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CRISPR/Cas(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated)系統是細菌在噬菌體長期選擇壓力下，進化出的一種有效的獲得性免疫機制。

 CRISPR簇廣泛存在于細菌和古細菌的基因組中，是一個特殊的DNA重復序列家族。其由一個前導區（leader）、多個重復序列區（repeat）和多個間隔區（spacer）構成。前導區被認為可能是CRISPR簇的啟動子，重復序列區可形成發卡結構，間隔區由俘獲的外源DNA組成。

 CRISPR簇附近存在一個多態性家族基因，編碼的蛋白質均具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性，并能與CRISPR區域發生相互作用，被命名為Cas（CRISPR associated）基因。

 當外源DNA入侵時，在前導區的調控下，CRISPR被轉錄為長的RNA前體（pre-CRISPR RNA， pre-crRNA），并通過加工成為一系列含有保守重復序列和間隔區的成熟crRNA，然后識別并結合到與其互補的外源DNA序列上發揮剪切作用。

 根據Cas蛋白質和參與序列的不同，將目前發現的CRISPR/Cas系統分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中，Ⅰ型和Ⅲ型需要多種Cas蛋白共同發揮作用，而Ⅱ型由Cas9單獨參與，是研究較為深入的一種類型。

 在pre-crRNA轉錄的同時，與其重復序列互補的反式激活crRNA（trans-activating crRNA，tracrRNA）也轉錄出來。Cas9首先與crRNA和tracrRNA結合形成復合物，此復合物通過與PAM序列結合并侵入DNA，形成RNA-蛋白-DNA復合結構，進而在與crRNA配對的序列靶點剪切雙鏈DNA。

 通過人工設計這兩種RNA，可以改造形成具有引導作用的sgRNA（single guide RNA），通過將表達sgRNA的元件與表達Cas9的元件相連接，得到可以同時表達兩者的質粒，便能夠對目的基因進行操作，以引導Cas9對DNA的定點切割。

CRISPR/Cas9系統的作用原理（Zhang Feng，2013）

 CRISPR/Cas9系統需要兩個關鍵基因序列：gRNA和Cas9，gRNA的功能是識別目的DNA序列，并引導Cas9蛋白到目的基因序列處進行切割。gRNA序列由兩部分組成：能夠與目的基因匹配的序列和能夠與Cas9蛋白結合的序列。Cas9是一種能切割DNA雙鏈的核酸內切酶，在匹配的基因的PAM序列的上游3-4堿基處進行DNA雙鏈的切割。

根據PAM序列的不同，Cas9分為spCas9和saCas9兩種。

 saCas9基因序列長約3.3kb，spCas9基因序列長約4.1kb，因為saCas9的基因序列要比spCas9的基因序列短很多，所以在克隆方面，saCas9要更為容易，且saCas9更適宜包裝成AAV病毒，當然兩者都可以包裝成腺病毒和慢病毒。saCas9和spCas9另外一個很大的區別是兩者識別的PAM序列不同，saCas9識別的PAM序列是5’-NNGRRT-3’,而spCas9識別的PAM序列為5’-NGG-3’,因為saCas9的PAM序列要比spCas9的PAM序列長，在基因組中出現的概率更低，相比于spCas9脫靶率要低，其gRNA設計也相對更困難。