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南京醫科大學附屬無錫人民醫院姚勇/魏婷婷團隊發現TGR5可能是糖尿病視網膜病變治療新靶點！

糖尿病視網膜病變(DR)是一種嚴重且相對未被認識到的糖尿病并發癥，Müller神經膠質細胞遍及視網膜，在維持視網膜穩態中起著至關重要的作用。先前研究表明，膽汁酸激活GPCR家族成員TGR5可以改善DR，但TGR5在調節 Müller細胞功能中的作用及其機制尚不清楚。2023年9月1日，南京醫科大學附屬無錫人民醫院姚勇和魏婷婷團隊在Cell Death and Disease（IF 9.0）上發表論文“TGR5 supresses cGAS/STING pathway by inhibiting GRP75-mediated endoplasmic reticulum-mitochondrial coupling in diabetic retinopathy”，研究發現TGR5是維持線粒體功能的關鍵因素，TGR5激動劑可預防視網膜損傷，而TGR5敲低可加重DR大鼠視網膜損傷，表明TGR5可能是治療DR的新靶點。

01 研究結果

神經膠質細胞（Müller glial cells）遍布視網膜，發揮維持視網膜穩態和完整性的功能。免疫熒光染色結果提示TGR5在Müller細胞中表達，TGR5激動劑INT-777顯著地挽救了高糖（HG）誘導的細胞活力下降。Müller細胞線粒體形態研究發現HG處理的細胞中線粒體分裂成短球體，INT-777顯著恢復線粒體形態，進一步研究發現TGR5可能通過PKCδ-Drp1途徑調節線粒體裂變。此外，INT-777上調線粒體呼吸鏈復合物如NDUFB8、SDHB、UQCRC2、MTCO1和ATP5A1的表達，且明顯減輕隨HG刺激而降低的MMP，表明TGR5激活改善了線粒體功能。通過轉染TGR5特異性siRNA，發現TGR5的下調加重了HG誘導的線粒體斷裂；同時，TGR5的下調導致MMP的降低。以上結果表明TGR5是介導線粒體功能的關鍵因素。

2、TGR5通過調節MAMs影響線粒體Ca²⁺穩態

作者進一步研究發現TGR5通過調節線粒體Ca²⁺水平來調節線粒體功能，MAMs介導Ca²⁺從內質網向線粒體的外排。HG處理的細胞中，MAM的形成增加，在INT-777處理后，線粒體和內質網之間的共定位顯著減少。因此，作者推測TGR5介導的線粒體Ca²⁺穩態是由MAMs調節的。IP3R1-GRP75-VDAC1軸被證明存在于MAMs中，負責從內質網到線粒體的Ca²⁺運輸。GRP75在HG條件下顯著上調，而TGR5的激活逆轉了其升高。免疫共沉淀和免疫熒光顯示HG培養增加了GRP75與VDAC1以及GRP75與IP3R1的結合，而INT-777處理可以抑制這些結合。與HG組相比，TGR5敲低促進了MAM的形成并降低了線粒體Ca²⁺水平。然而，TGR5沉默對MAM形成和線粒體Ca²⁺過載的影響被GRP75沉默顯著逆轉。這些發現證實，TGR5抑制GRP75的表達導致IP3R1-GRP75-VDAC1復合物的形成受阻，從而降低線粒體Ca²⁺水平。

3、TGR5激活可阻斷cGAS-STING介導的炎癥反應，減輕DR大鼠視網膜損傷

 作者進一步探究TGR5對線粒體穩態和cGAS-STING通路的調控作用，發現TGR5激活可以維持線粒體穩態，進而抑制cGAS-STING介導的炎癥反應。為進一步闡明TGR5在DR中的作用，作者利用STZ誘導的DR大鼠進行了后續實驗。DR大鼠VEGF表達升高，而INT-777抑制其異常升高；同時，INT-777抑制DR大鼠的8-OHdG的上調，說明視網膜DNA損傷得到一定程度的修復。作者還觀察到DR大鼠心肌細胞形態的異常，這種現象被INT-777改善。此外，WB分析顯示，INT-777顯著降低視網膜炎癥因子TNF-α、IL-6和IFN-β的表達。與體外實驗結果一致，DR大鼠視網膜中GRP75上調，cGAS-STING信號被激活，INT-777下調GRP75、cGAS和p-STING信號。綜上所述，TGR5激活阻斷了cGAS-STING介導的炎癥反應，減輕了DR大鼠視網膜損傷。

4、STING抑制劑可改善AAV-shTGR5誘導的DR大鼠視網膜功能障礙加重

接下來，作者探討了TGR5與cGAS-STING之間的關系，利用AAV-shTGR5敲低DR大鼠視網膜TGR5，檢測發現AAV-shTGR5顯著沉默TGR5表達。與對照組相比，AAV-shTGR5組視網膜外核層(ONL)和內核層(INL)變薄，給藥H-151可以逆轉這一現象。在AAV-shTGR5組中，cleaved caspase-3顯著上調，而H-151處理顯著減少了視網膜細胞凋亡。STZ處理導致VEGF表達升高，AAV-shTGR5進一步強化VEGF表達，H-151逆轉了這種效應。電鏡顯示糖尿病視網膜毛細血管基底膜較對照組明顯增厚，AAV-shTGR5進一步加重了基底膜增厚。TGR5可能通過負調控cGAS-STING信號通路來影響Müller細胞的炎癥反應。