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Cell Metabolism：武漢同濟醫院李鋒教授團隊發現新型Nrf2激活劑或可通過抑制破骨細胞分化緩解骨質疏松

2024年3月28日，華中科技大學同濟醫學院附屬同濟醫院李鋒教授團隊在Cell Metabolism，IF 29上在線發表了題為“A clinical-stage Nrf2 activator suppresses osteoclast differentiation via the iron-ornithine axis”的研究成果，本研究確定了一種新型臨床階段Nrf2激活劑-Bitopertin，該激活劑通過Nrf2-鐵鳥氨酸途徑抑制破骨細胞分化并改善雌激素消耗誘導的骨質流失。在人類受試者中，該激活劑比現有的臨床Nrf2激活劑具有更少的不良事件，表明Bitopertin可能是治療骨質疏松癥和其他Nrf2相關疾病的良好候選藥物。

一、 研究背景

 絕經后骨質疏松癥是在缺乏雌激素的情況下由破骨細胞過度活化引起的代謝紊亂。骨密度(BMD)降低使患者更易患髖部或椎體脆性骨折，在全球范圍內造成嚴重殘疾和社會經濟負擔。通過小分子激活Nrf2是治療絕經后骨質疏松癥的一種很有前途的策略，然而，目前還沒有批準用于治療慢性疾病的Nrf2激活劑，且Nrf2調控破骨細胞分化的下游機制仍尚不清楚。

二、 研究結果

作者首先通過灌胃研究了bitopertin對OVX小鼠骨量的影響，發現bitopertin通過抑制體內破骨細胞形成來改善OVX誘導的骨質疏松癥。進一步研究發現bitopertin在抑制破骨細胞分化和減輕OVX誘導的骨質疏松方面具有非甘氨酸依賴性的作用。為研究bitopertin的作用靶點，作者對MCSF-、RANKL-和bitopertin治療的骨髓源性巨噬細胞（BMDMs）進行了RNA測序。通過數據分析和實驗驗證推測Nrf2可能是介導bitopertin作用的核心調節因子，并檢測Nrf2在mRNA和蛋白水平上的表達，發現bitopertin處理沒有改變Nrf2的mRNA表達，但蛋白水平顯著升高，而Nrf2抑制因子Keap1的表達未被bitopertin改變。體內組織免疫熒光分析顯示，bitopertin處理小鼠股骨小梁Nrf2表達增加。通過計算機模擬分子對接分析以研究bitopertin對Keap1-Nrf2復合物的影響，發現兩種蛋白之間的相互作用被bitopertin處理劑量依賴性地抑制。隨后，免疫共沉淀和泛素化實驗表明bitopertin治療可減少Nrf2免疫沉淀的Keap1。Bitopertin處理后，Nrf2的泛素化水平降低，Nrf2的蛋白穩定性增加。這些數據表明，Bitopertin通過直接結合Keap1的Kelch結構域激活Nrf2，并降低Keap1-Nrf2相互作用。

接下來，作者使用Nrf2-/-小鼠進一步驗證了Nrf2是Bitopertin的靶標，與WT小鼠相比，bitopertin并沒有增加Nrf2-/-小鼠的骨小梁質量、骨參數和血清CTX水平。Nrf2敲除在體外促進破骨細胞分化，bitopertin對破骨細胞的抑制作用被消除。表明bitopertin對破骨細胞分化和OVX誘導的骨質流失的抑制作用是通過Nrf2激活介導的。接下來，作者比較了bitopertin與兩種臨床批準的親電Nrf2激活劑OMA (30 mg/kg)和DMF (50 mg/kg)的療效和安全性，發現與DMF、OMA或bardoxolone相關的任何不良事件或嚴重不良事件的發生率顯著高于與bitopertin相關的不良事件，表明bitopertin可能是臨床使用的更安全的Nrf2激活劑候選藥。進一步探究Nrf2抑制破骨細胞分化的下游機制，發現Nrf2激活鐵轉運蛋白編碼基因Slc40a1的轉錄，NFE2L2（編碼Nrf2的基因）-SLC40A1軸在骨質疏松癥患者的破骨細胞前體中受到抑制。

Slc40a1是哺乳動物細胞中唯一的鐵轉運蛋白的編碼基因。RNA-seq數據的GSEA分析顯示，在RANKL處理的Nrf2-/-和WT bmdm之間，鐵的攝取和運輸途徑發生了顯著變化。在RANKL治療的BMDMs中，Nrf2激活劑bitopertin降低了細胞內鐵，但在Nrf2-/- BMDMs中，這種降低是逆轉的。隨后，我們通過腺病毒shRNA敲除Slc40a1的表達，發現Slc40a1沉默減弱了bitopertin的降鐵作用，表明Slc40a1是Nrf2調控破骨細胞鐵代謝的重要效應因子。進一步探究鐵代謝是否介導Nrf2對破骨細胞的影響，發現在OVX模型中，敲除BMDMs中的Nrf2可增加細胞內鐵水平，激活破骨細胞分化，并加劇骨質流失。然而，DFO螯合鐵可以逆轉Nrf2敲除引起的破骨細胞過度活化和骨質流失。臨床數據分析表明，鐵含量過高會增加患骨質疏松癥的風險。

最近的兩項研究表明Nrf2和鐵都可以調節核苷酸代謝，作者對DFO處理的Nrf2-/- BMDMs進行代謝組學分析，以研究Nrf21和鐵調節的代謝途徑。代謝產物KEGG分析表明，精氨酸和脯氨酸代謝途徑是變化最顯著的途徑，熱圖顯示，DFO處理后，該通路中大部分差異代謝物上調。由于鳥氨酸是一種上游代謝物，可以被代謝成許多其他代謝物，作者重點研究了鳥氨酸，發現DFO處理增加了鳥氨酸的豐度，降低了亞精胺的豐度。在WT BMDMs中，用bitopertin激活Nrf2可增加細胞內鳥氨酸水平；相反，Nrf2-/- BMDMs顯示鳥氨酸水平下降，DFO治療顯著增加了Nrf2-/- BMDMs中鳥氨酸的水平，表明鳥氨酸是受Nrf2和鐵調控的下游代謝物，影響破骨細胞分化。隨后，作者探究了Nrf2和鐵如何調節細胞內鳥氨酸水平，發現Nrf2-/- BMDMs抑制Odc1表達，阻止鳥氨酸向亞精胺的轉化，導致鳥氨酸水平升高，Odc1受Nrf2和鐵的調控，影響鳥氨酸代謝、破骨細胞分化和骨量。