Cell Death & Disease (IF 9.0)｜山東省腫瘤醫院張松團隊揭示METTL3在結直腸癌中的致癌機制
N6-甲基腺苷（m6A）是一種(zhong)(zhong)在(zai)(zai)哺乳動物信使RNA中(zhong)普遍存在(zai)(zai)的(de)(de)(de)內部修飾，占RNA修飾的(de)(de)(de)80%以上。據報道，m6A修飾涉及一系列(lie)生物學過程，包括(kuo)干(gan)細(xi)胞自我更新和分化、DNA損傷修復(fu)、免疫調節、性別決定等(deng)。除了正常的(de)(de)(de)生理(li)活動外，m6A還與包括(kuo)癌(ai)(ai)癥在(zai)(zai)內的(de)(de)(de)多種(zhong)(zhong)疾病(bing)的(de)(de)(de)發病(bing)機制(zhi)有關。METTL3是一種(zhong)(zhong)甲基轉移酶，具有致癌(ai)(ai)作用，已(yi)知由METTL3介導的(de)(de)(de)m6A修飾在(zai)(zai)幾種(zhong)(zhong)癌(ai)(ai)癥中(zhong)的(de)(de)(de)作用已(yi)被(bei)闡明，但(dan)其在(zai)(zai)結直腸癌(ai)(ai)中(zhong)發揮功能的(de)(de)(de)具體機制(zhi)仍不清楚(chu)。
2023年11月(yue)，山(shan)東第一(yi)醫(yi)科大學附(fu)屬腫(zhong)瘤醫(yi)院張松(song)研究團隊(dui)在Cell Death & Disease (IF 9.0)上(shang)發(fa)表“METTL3 promotes colorectal cancer progression through activating JAK1/STAT3 signaling pathway”文章。研究揭示(shi)了METTL3具有作(zuo)為m6A“寫入器”和轉(zhuan)錄調(diao)節因(yin)子的雙重作(zuo)用，通過(guo)m6A/YTHDF1軸上(shang)調(diao)JAK1的表達，同時協同NF-κB增強STAT3轉(zhuan)錄，導致STAT3信號通路激活和結直腸癌進展。
研究結果與方法
1、METTL3在結直腸癌細胞中(zhong)表達上調并發揮(hui)促癌作(zuo)用
采用(yong)蛋白質(zhi)印跡、免疫組化(hua)染(ran)色并結(jie)(jie)合生(sheng)物信息學(xue)分析，研究(jiu)人員(yuan)發(fa)現結(jie)(jie)直腸癌組織(zhi)中m6A和(he)METTL3的(de)(de)表達均上(shang)調(diao)。為(wei)了(le)(le)進一步闡明(ming)METTL3介(jie)導的(de)(de)m6A靶向基因調(diao)控的(de)(de)機制(zhi)，使用(yong)慢病毒介(jie)導的(de)(de)shRNA轉染(ran)建(jian)立了(le)(le)METTL3穩(wen)定降(jiang)低(di)的(de)(de)結(jie)(jie)直腸癌細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)系HCT116和(he)LoVo細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)。集落形成、MTT測定以及(ji)Transwell分析顯示(shi)，METTL3敲低(di)顯著抑制(zhi)了(le)(le)癌細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)的(de)(de)增殖及(ji)遷移，流式細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)術(shu)檢測發(fa)現多數METTL3沉默的(de)(de)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)其周期停(ting)滯在G1/G0期，但細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)凋亡沒有(you)發(fa)生(sheng)明(ming)顯變化(hua)。因此(ci)，METTL3可(ke)能通過調(diao)節(jie)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)周期和(he)遷移來(lai)發(fa)揮(hui)促癌作(zuo)用(yong)，但不依賴于細(xi)(xi)胞(bao)(bao)(bao)凋亡控制(zhi)。
圖1. METTL3在結直腸癌細胞中的促癌作用
2、METTL3沉(chen)默對JAK1/STAT3信(xin)號(hao)通路的影(ying)響
斑(ban)點雜交結(jie)果顯(xian)示METTL3沉默的(de)癌(ai)癥(zheng)細(xi)胞(bao)中RNA m6A水平(ping)(ping)顯(xian)著降低，隨后對METTL3缺失或(huo)對照(zhao)HCT116細(xi)胞(bao)進行(xing)了甲基(ji)化(hua)RNA免疫沉淀(dian)和(he)RNA測序（MeRIP-seq），途徑富集統(tong)計發現JAK/STAT信號(hao)通路表(biao)達(da)(da)差異顯(xian)著。WB結(jie)果表(biao)明(ming)METTL3沉默顯(xian)著抑制了STAT3的(de)磷酸(suan)化(hua)，并(bing)明(ming)顯(xian)降低JAK1和(he)STAT3的(de)表(biao)達(da)(da)。研究人員利(li)用攜(xie)帶(dai)CRISPR/Cas9系統(tong)的(de)慢病(bing)毒載(zai)體(ti)構建了METTL3敲除的(de)HCT116細(xi)胞(bao)（KO-C4、KO-C7），實時PCR研究發現，METTL3基(ji)因敲除在(zai)(zai)mRNA水平(ping)(ping)上(shang)(shang)顯(xian)著下調STAT3的(de)表(biao)達(da)(da)，但對JAK1 mRNA的(de)表(biao)達(da)(da)沒有影(ying)響(xiang)；外源性(xing)過(guo)表(biao)達(da)(da)野生(sheng)(sheng)型(xing)(xing)METTL3（WT-METTL3）和(he)突變體(ti)METTL3 (D395A/W398A)，發現野生(sheng)(sheng)型(xing)(xing)或(huo)突變型(xing)(xing)METTL3過(guo)表(biao)達(da)(da)均挽(wan)救了STAT3的(de)表(biao)達(da)(da)，但只有WT-METTL3挽(wan)救了JAK1的(de)表(biao)達(da)(da)，而突變型(xing)(xing)METTL3過(guo)表(biao)達(da)(da)未能挽(wan)救JAK1的(de)表(biao)達(da)(da)。上(shang)(shang)述(shu)數據表(biao)明(ming)，METTL3以m6A依賴的(de)方式(shi)在(zai)(zai)蛋白(bai)質水平(ping)(ping)而不是mRNA水平(ping)(ping)上(shang)(shang)調節JAK1的(de)表(biao)達(da)(da)，并(bing)影(ying)響(xiang)STAT3 mRNA的(de)表(biao)達(da)(da)，這共同促進了結(jie)直腸(chang)癌(ai)細(xi)胞(bao)JAK1/STAT3信號(hao)通路的(de)激活。
圖2. METTL3沉默對JAK1/STAT3信號通路的影響
3、YTHDF1以(yi)m6A依賴的方式促進JAK1 mRNA翻譯(yi)
大量(liang)證據表明，YTHDF1能(neng)(neng)夠通(tong)過識別靶RNA的(de)(de)m6A 位點(dian)促進(jin)其翻譯。研究者利(li)用(yong)慢病毒(du)載體構建(jian)了YTHDF1沉默的(de)(de)HCT116細(xi)胞系，蛋白(bai)質(zhi)印跡研究顯(xian)示，YTHDF1敲低可(ke)有(you)(you)效抑制STAT3磷酸化(hua)，并降低JAK1的(de)(de)表達(da)(da)水(shui)平，但對STAT3的(de)(de)表達(da)(da)沒有(you)(you)影響。RIP和定(ding)量(liang)實時(shi)PCR分析發現JAK1 mRNA在YTHDF1免疫(yi)沉淀物中富集，并且(qie)在METTL3敲除(chu)后，這種相(xiang)互(hu)作用(yong)明顯(xian)減弱(ruo)，表明m6A在YTHDF1和JAK1 mRNA的(de)(de)相(xiang)互(hu)作用(yong)中具有(you)(you)不可(ke)或(huo)缺性。此外，YTHDF1的(de)(de)沉默顯(xian)著抑制了細(xi)胞增殖、遷移，上述(shu)數據表明，METTL3依(yi)賴(lai)YTHDF1與JAK1 m6A位點(dian)的(de)(de)結合能(neng)(neng)力來促進(jin)JAK1翻譯，導致STAT3途(tu)徑(jing)激活和癌癥進(jin)展。
進一(yi)步(bu)分析發現(xian)METTL3和NF-κB協同促進STAT3的轉(zhuan)錄，STAT3信(xin)號通路在METTL3介導的結直腸癌細胞(bao)增(zeng)殖和遷移(yi)中(zhong)起著重要(yao)作用(yong)。
圖3. YTHDF1以m6A依賴的方式促進JAK1 mRNA的翻譯
4、METTL3和YTHDF1在(zai)體內(nei)促(cu)進腫(zhong)瘤生長和轉移
最后，為(wei)了探討METTL3在(zai)體內調節腫(zhong)瘤發生的(de)(de)作用，將METTL3缺(que)(que)失(shi)(shi)或非缺(que)(que)失(shi)(shi)的(de)(de)結(jie)(jie)直腸癌(ai)細胞皮下(xia)注(zhu)(zhu)射到BALB/c裸鼠(shu)中(zhong)(zhong)，結(jie)(jie)果(guo)顯示METTL3的(de)(de)敲除(chu)有(you)效(xiao)地延(yan)緩了腫(zhong)瘤生長。利用肺轉移(yi)(yi)小鼠(shu)模型檢測發現尾靜脈注(zhu)(zhu)射METTL3非缺(que)(que)失(shi)(shi)的(de)(de)HCT116對照細胞導(dao)致嚴(yan)重的(de)(de)肺轉移(yi)(yi)，而METTL3的(de)(de)缺(que)(que)失(shi)(shi)幾(ji)乎(hu)完全消除(chu)了轉移(yi)(yi)性淋(lin)巴(ba)結(jie)(jie)的(de)(de)形成。進一步將YTHDF1缺(que)(que)失(shi)(shi)的(de)(de)癌(ai)癥細胞注(zhu)(zhu)射到裸鼠(shu)中(zhong)(zhong)，以建立荷瘤和肺轉移(yi)(yi)小鼠(shu)模型，YTHDF1沉默(mo)后，腫(zhong)瘤負(fu)荷明顯減輕，肺組織中(zhong)(zhong)的(de)(de)轉移(yi)(yi)結(jie)(jie)更(geng)少(shao)。此外，在(zai)METTL3或YTHDF1缺(que)(que)失(shi)(shi)的(de)(de)異種移(yi)(yi)植物中(zhong)(zhong)，STAT3信號相(xiang)關蛋(dan)白的(de)(de)表達水平均降低。上(shang)述研(yan)究結(jie)(jie)果(guo)表明，METTL3以m6A依賴(lai)性和非依賴(lai)性的(de)(de)方式同時上(shang)調JAK1和STAT3的(de)(de)表達，這有(you)助于(yu)STAT3信號激活(huo)，導(dao)致癌(ai)癥在(zai)體外和體內的(de)(de)增殖和進展。
圖4. METTL3和YTHDF1在體內促進腫瘤生長和轉移
小(xiao)結
本研究表明METTL3通過以m6A依賴性和(he)(he)非(fei)依賴性的(de)方式上調(diao)JAK1和(he)(he)STAT3的(de)表達，有助(zhu)于(yu)p-STAT3信號通路(lu)的(de)激活并促進結(jie)直(zhi)腸(chang)癌的(de)進展。因(yin)此(ci)，同時(shi)抑制p-STAT3和(he)(he)METTL3可能為結(jie)直(zhi)腸(chang)癌治(zhi)療開辟新的(de)前景(jing)。
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