當前位置：首頁 > 新聞中心 > 新聞資訊
病毒產品：AdM-CMV-mCherry-EGFP-LC3B ; 感染細胞：H4細胞（人腦神經膠質瘤細胞）
原文鏈接：
線粒(li)(li)體(ti)是細(xi)胞(bao)ATP產生，三羧酸(suan)循環，脂類，鐵硫簇，血紅素合(he)成的(de)主要(yao)場所，同時(shi)也是細(xi)胞(bao)內活性氧（ROS）的(de)主要(yao)來源。線粒(li)(li)體(ti)功能與細(xi)胞(bao)的(de)生存與代謝密切(qie)相(xiang)關，線粒(li)(li)體(ti)參與了自噬，凋亡，細(xi)胞(bao)分裂，信(xin)號傳(chuan)遞(di)等(deng)幾(ji)乎(hu)所有的(de)生化過程。線粒(li)(li)體(ti)功能的(de)紊(wen)亂(luan)可以導致許多疾病的(de)發生，如費(fei)氏共濟失(shi)調，阿爾茨海默(mo)癥，帕金森(sen)病，糖尿病，Leber視(shi)神經病等(deng)。
在ROS、營養缺乏(fa)、細胞(bao)衰老等(deng)外(wai)界刺(ci)激(ji)的作(zuo)用下(xia)，細胞(bao)內的線粒(li)體(ti)發生去極化出現損(sun)(sun)傷。損(sun)(sun)傷的線粒(li)體(ti)被特(te)異性的包(bao)裹進(jin)自噬(shi)體(ti)中(zhong)并與(yu)溶酶體(ti)融合，從而完成(cheng)線粒(li)體(ti)的降解，維持細胞(bao)內環境的穩定(ding)，這個(ge)過(guo)程被稱(cheng)為線粒(li)體(ti)自噬(shi)。
線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)自(zi)(zi)噬是由PINK1 - Parkin介導(dao)的選擇性清除多余或(huo)受損線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)的自(zi)(zi)噬過(guo)程(cheng)。正常(chang)條件下，PTEN誘導(dao)激(ji)酶(mei)(mei)1 (PINK1)通過(guo)線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)靶向序列連(lian)續靶向線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)，并(bing)被(bei)(bei)基質處理肽酶(mei)(mei)MPP降(jiang)解，隨后被(bei)(bei)線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)內膜(mo)中(zhong)(zhong)的蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)PARL切(qie)割，裂解的PINK轉運到胞(bao)漿，并(bing)被(bei)(bei)蛋(dan)白(bai)酶(mei)(mei)體(ti)降(jiang)解。當(dang)線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)受損時，PINK1通過(guo)外(wai)膜(mo)轉位酶(mei)(mei)（TOM）在(zai)(zai)線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)外(wai)膜(mo)積累，激(ji)活并(bing)招募Parkin，隨后線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)外(wai)膜(mo)上的蛋(dan)白(bai)VDAC1和Mfn1/2被(bei)(bei)Parkin泛素化，誘導(dao)線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)自(zi)(zi)噬。泛素化后，包(bao)括p62在(zai)(zai)內的受體(ti)蛋(dan)白(bai)在(zai)(zai)線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)外(wai)膜(mo)中(zhong)(zhong)積累，導(dao)致泛素化的貨物通過(guo)與LC3結合(he)被(bei)(bei)招募到自(zi)(zi)噬體(ti)中(zhong)(zhong)，成(cheng)熟的自(zi)(zi)噬體(ti)與溶酶(mei)(mei)體(ti)融合(he)形成(cheng)自(zi)(zi)噬溶酶(mei)(mei)體(ti)，包(bao)含的線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)隨后被(bei)(bei)降(jiang)解。
mCherry-EGFP-LC3B雙熒光指示體系：GFP熒(ying)(ying)光(guang)(guang)蛋(dan)(dan)白是酸敏感型蛋(dan)(dan)白，而mCherry是穩定的(de)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)表(biao)達基團。自噬形(xing)成(cheng)(cheng)時，mCherry-GFP-LC3融(rong)合蛋(dan)(dan)白轉移(yi)至自噬體(ti)膜，在(zai)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)顯微鏡下形(xing)成(cheng)(cheng)多個(ge)明亮的(de)黃色(se)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)斑點(dian)。當(dang)自噬溶酶體(ti)形(xing)成(cheng)(cheng)后，酸性(xing)的(de)溶酶體(ti)環境(jing)使GFP熒(ying)(ying)光(guang)(guang)淬滅，mCherry熒(ying)(ying)光(guang)(guang)不受影響，自噬溶酶體(ti)呈現紅色(se)熒(ying)(ying)光(guang)(guang)。因(yin)此，通過mCherry-EGFP-LC3B雙熒(ying)(ying)光(guang)(guang)指示(shi)體(ti)系可以非(fei)常有效地(di)追蹤自噬過程(cheng)。
（更多自噬檢測方法請點擊 關于『自噬』，你了解多少？進行查看）
mt-Keima：Keima蛋白定位于(yu)線粒(li)體(ti)，具有在酸性(xing)和中性(xing)pH中熒光(guang)信號不同的特(te)性(xing)，可(ke)以直(zhi)觀(guan)地反映線粒(li)體(ti)自噬程(cheng)度。
MitoTracker：用于對活細胞線(xian)粒體(ti)進行(xing)染色(se)。
LysoTracker：用于(yu)標(biao)記和跟蹤活(huo)細胞中的溶酶體。
DQ-BSA染料：一(yi)種被熒光(guang)染料標(biao)記的(de)(de)自淬的(de)(de)蛋(dan)白質，一(yi)旦(dan)進入溶酶體(ti)，DQ-BSA就(jiu)會被溶酶體(ti)蛋(dan)白酶裂解，導致熒光(guang)片段的(de)(de)不(bu)淬滅和釋放，發出明亮的(de)(de)熒光(guang)。因此，DQ-BSA可用來(lai)指示溶酶體(ti)的(de)(de)功(gong)能是否正常(chang)。
術后認(ren)知(zhi)(zhi)功能(neng)障礙(Post operative cognitive dysfunction，POCD)是老(lao)(lao)(lao)年(nian)人手術后出現的(de)一種中(zhong)樞(shu)神(shen)經(jing)系(xi)統并發癥(zheng)，表現為(wei)術后記(ji)憶(yi)力(li)和集中(zhong)力(li)下(xia)降、精神(shen)錯亂、焦(jiao)慮等。高(gao)齡是發生(sheng)POCD的(de)主要危險因(yin)素(su)之(zhi)一，越來(lai)越多的(de)證據表明麻醉會引起POCD老(lao)(lao)(lao)年(nian)患者的(de)神(shen)經(jing)毒性和神(shen)經(jing)認(ren)知(zhi)(zhi)能(neng)力(li)下(xia)降。對POCD老(lao)(lao)(lao)年(nian)大(da)鼠模(mo)型的(de)研(yan)(yan)究表明，七氟醚（Sevoflurane，一種麻醉藥物(wu)）可(ke)誘(you)導神(shen)經(jing)元凋亡(wang)導致學習和記(ji)憶(yi)缺失；此(ci)外(wai)，線粒(li)(li)體自噬(shi)功能(neng)障礙也被認(ren)為(wei)與(yu)POCD相關。作(zuo)者先前(qian)的(de)研(yan)(yan)究已表明，自噬(shi)功能(neng)障礙與(yu)七氟醚誘(you)導的(de)老(lao)(lao)(lao)年(nian)大(da)鼠POCD有關。然而，尚不(bu)清楚線粒(li)(li)體自噬(shi)受損是否與(yu)老(lao)(lao)(lao)年(nian)大(da)鼠POCD的(de)發病機制相關。
使用七氟醚(mi)(mi)處理(li)(li)H4細胞，線(xian)(xian)(xian)粒體(ti)(ti)中的(de)ROS水(shui)平(ping)(ping)大幅(fu)升高，并且隨處理(li)(li)時間的(de)延長而(er)增加，同時膜電位(wei)下降，細胞質鈣(gai)水(shui)平(ping)(ping)升高，線(xian)(xian)(xian)粒體(ti)(ti)呼吸(xi)功能(neng)受抑(yi)，表明七氟醚(mi)(mi)破壞了H4細胞的(de)線(xian)(xian)(xian)粒體(ti)(ti)平(ping)(ping)衡；使用七氟醚(mi)(mi)處理(li)(li)老年(nian)大鼠(shu)，發現線(xian)(xian)(xian)粒體(ti)(ti)變小，Tomm20（線(xian)(xian)(xian)粒體(ti)(ti)外(wai)膜轉位(wei)酶(mei)）的(de)表達水(shui)平(ping)(ping)顯著(zhu)升高，海(hai)馬區LAMP1（溶酶(mei)體(ti)(ti)相(xiang)關膜蛋白1）的(de)表達水(shui)平(ping)(ping)降低，此外(wai)線(xian)(xian)(xian)粒體(ti)(ti)分裂蛋白Fis1表達增加，融合蛋白OPA1和 Mfn2表達降低，表明七氟醚(mi)(mi)引起了老年(nian)大鼠(shu)的(de)線(xian)(xian)(xian)粒體(ti)(ti)損(sun)傷并影響了溶酶(mei)體(ti)(ti)的(de)功能(neng)（見原(yuan)文(wen)圖1，圖2）。
為探(tan)討七(qi)(qi)氟(fu)醚是否會影(ying)響線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)自(zi)(zi)(zi)噬(shi)過程，將AdM-CMV-mCherry-EGFP-LC3B轉(zhuan)染H4細胞(bao)，免(mian)疫熒光(guang)(guang)(guang)定(ding)量表(biao)明(ming)，SEV組(zu)(zu)GFP的(de)熒光(guang)(guang)(guang)強(qiang)(qiang)度(du)強(qiang)(qiang)于對照組(zu)(zu)，但RFP的(de)熒光(guang)(guang)(guang)強(qiang)(qiang)度(du)沒有差異(yi)（表(biao)明(ming)自(zi)(zi)(zi)噬(shi)過程受(shou)阻）。使用mt-Keima測(ce)量線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)自(zi)(zi)(zi)噬(shi)通(tong)量，加入線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)自(zi)(zi)(zi)噬(shi)誘導劑CCCP時(shi)，H4細胞(bao)的(de)紅(hong)色熒光(guang)(guang)(guang)增(zeng)強(qiang)(qiang)，表(biao)明(ming)線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)自(zi)(zi)(zi)噬(shi)被誘導。SEV組(zu)(zu)與(yu)對照組(zu)(zu)相比具有較低的(de)紅(hong)色熒光(guang)(guang)(guang)，這說明(ming)七(qi)(qi)氟(fu)醚抑制了H4細胞(bao)線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)自(zi)(zi)(zi)噬(shi)功能。MitoTracker（紅(hong)色熒光(guang)(guang)(guang)指(zhi)示）和LysoTracker（綠色熒光(guang)(guang)(guang)指(zhi)示）實(shi)驗結果表(biao)明(ming)，七(qi)(qi)氟(fu)醚處理后H4細胞(bao)中(zhong)(zhong)線(xian)(xian)粒(li)體(ti)(ti)數量增(zeng)加，而溶(rong)酶(mei)體(ti)(ti)數量未發生變(bian)化。此外(wai)，H4細胞(bao)中(zhong)(zhong)DQ-BSA熒光(guang)(guang)(guang)強(qiang)(qiang)度(du)顯著降低，表(biao)明(ming)溶(rong)酶(mei)體(ti)(ti)功能受(shou)損。WB法檢測(ce)原代培養神經元 LC3B、p62和Tomm20的(de)蛋(dan)白水(shui)平，發現與(yu)Ctrl組(zu)(zu)相比， SEV組(zu)(zu)的(de)三種蛋(dan)白表(biao)達(da)水(shui)平均較高。（圖3）。
體(ti)內實驗檢測老年大鼠海(hai)(hai)馬中(zhong)SEV-6h組LC3BII/I、p62和(he)Tomm20三(san)種蛋白的表達(da)同樣上調，并且七(qi)氟醚處理后老齡大鼠海(hai)(hai)馬區cathepsin B（溶酶體(ti)組織(zhi)蛋白酶B，參與(yu)自噬降解(jie) ）表達(da)水平顯著(zhu)降低，而(er)且成(cheng)熟形式的cathepsin B幾乎消失(shi)（圖(tu)4）。
結合體內外實驗結果：七氟(fu)醚可誘導體內外溶(rong)酶體功能及線粒體自(zi)噬功能受損，阻斷自(zi)噬溶(rong)酶體的形(xing)成(cheng)。
H4細胞中自(zi)噬誘導劑雷帕(pa)霉素(su)的(de)(de)加入(ru)顯(xian)著降低了七氟醚(mi)引起(qi)的(de)(de)胞內(nei)和線(xian)粒體內(nei)ROS水平(ping)的(de)(de)升高，并(bing)改(gai)善(shan)了老年(nian)大鼠海馬線(xian)粒體的(de)(de)形(xing)態。熒(ying)光成像和定(ding)量數(shu)據表明(ming)，經雷帕(pa)霉素(su)處(chu)理后，SEV組LAMP1的(de)(de)熒(ying)光強度增強，Tomm20的(de)(de)熒(ying)光強度降低，表明(ming)雷帕(pa)霉素(su)改(gai)善(shan)了七氟醚(mi)引起(qi)的(de)(de)溶酶體及(ji)線(xian)粒體功能(neng)的(de)(de)受損。
雷帕霉(mei)素處理后，SEV組(zu)GFP的(de)熒光強度(du)明顯降低(di)，說明雷帕霉(mei)素恢復了自(zi)噬(shi)通(tong)量。經(jing)(jing)WB檢測，雷帕霉(mei)素處理后原(yuan)代(dai)培(pei)養神經(jing)(jing)元和大鼠(shu)海馬中自(zi)噬(shi)標記物p62、Tomm20表達水平均降低(di)。上述體內外實驗結果說明雷帕霉(mei)素逆轉(zhuan)了七氟醚誘導的(de)線粒體自(zi)噬(shi)功(gong)能障礙（圖5）。
行為學試驗（莫里(li)斯水(shui)迷宮）和(he)對海(hai)馬錐體神經(jing)元和(he)神經(jing)元樹突的染(ran)色觀(guan)察實(shi)驗，發現老年大(da)鼠(shu)的認(ren)知功能障礙是由海(hai)馬錐體神經(jing)元中(zhong)樹突棘數(shu)(shu)目的減少導致的，雷帕霉素可(ke)減輕海(hai)馬神經(jing)元中(zhong)樹突棘數(shu)(shu)量的減少，改善大(da)鼠(shu)認(ren)知缺陷(xian)。（見原(yuan)文圖(tu)7）。
最后，為了(le)闡明(ming)七氟醚(mi)誘導(dao)線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)(ti)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)功(gong)能(neng)障(zhang)礙的可(ke)能(neng)機(ji)制(zhi)，作者對(dui)Cox4l1（細(xi)胞(bao)色素(su)氧化(hua)酶）和Parkin蛋白在(zai)線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)(ti)和細(xi)胞(bao)質中的積累進行(xing)了(le)檢測(ce)。WB結果(guo)表(biao)明(ming)，mito-SEV組(zu)Parkin蛋白表(biao)達量低(di)于(yu)mito-Ctrl組(zu)。將(jiang)EGFP-PARK2 質粒(li)(li)(li)(li)轉染H4細(xi)胞(bao)，發現胞(bao)內及線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)(ti)內ROS水平降低(di)，并且線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)(ti)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)增強，同時由七氟醚(mi)引起(qi)的的線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)(ti)自(zi)(zi)噬(shi)(shi)功(gong)能(neng)障(zhang)礙得到緩解。這些結果(guo)表(biao)明(ming)，七氟醚(mi)通過抑(yi)制(zhi)PARK2的表(biao)達影響線(xian)(xian)(xian)粒(li)(li)(li)(li)體(ti)(ti)正常自(zi)(zi)噬(shi)(shi)功(gong)能(neng)（圖6）。
作者結合體內外實(shi)驗，在(zai)多方面(mian)證實(shi)了(le)七氟(fu)醚可誘導體內外線(xian)粒(li)(li)體損(sun)傷(shang)及溶酶體功(gong)能(neng)(neng)受(shou)(shou)損(sun)，阻斷線(xian)粒(li)(li)體自噬(shi)過程(cheng)中自噬(shi)溶酶體的(de)形(xing)成，影響線(xian)粒(li)(li)體的(de)正常自噬(shi)功(gong)能(neng)(neng)；自噬(shi)誘導劑雷帕霉素可改善七氟(fu)醚引起(qi)的(de)線(xian)粒(li)(li)體損(sun)傷(shang)及線(xian)粒(li)(li)體自噬(shi)功(gong)能(neng)(neng)受(shou)(shou)阻及老年大鼠(shu)認知障(zhang)(zhang)礙(ai)。本研究闡述了(le)線(xian)粒(li)(li)體自噬(shi)功(gong)能(neng)(neng)障(zhang)(zhang)礙(ai)可能(neng)(neng)是(shi)七氟(fu)醚誘導的(de)術后(hou)認識障(zhang)(zhang)礙(ai)的(de)機制，為術后(hou)認知障(zhang)(zhang)礙(ai)的(de)治療提供了(le)一種新的(de)策略。
維真生物(wu)擁有兩大人源(yuan)基(ji)因腺病(bing)毒(du)(du)(du)現(xian)貨(huo)庫——12000個ORF腺病(bing)毒(du)(du)(du)和1200余個miRNA腺病(bing)毒(du)(du)(du)。此外，還有幾十余種(zhong)常備腺病(bing)毒(du)(du)(du)現(xian)貨(huo)，覆蓋熒光蛋白、Cre重組酶、LacZ和細胞自(zi)噬等功能基(ji)因。
? 腺病毒均已(yi)純化，滴度高(gao)，可(ke)直(zhi)接用于體內外實驗；
? 具有競爭力的價格；
? 感染效率高(gao)，是難感染細胞的理想選擇(ze)；
? 交貨時間(jian)短(duan)，3-4周即可發貨；
? 承諾在HEK293細胞中蛋白表達(da)；（無效退款）
維真生物擁(yong)有豐富的腺(xian)病(bing)毒包裝經驗，可為(wei)客(ke)戶提供體內(nei)外實驗所需(xu)的各(ge)種規格腺(xian)病(bing)毒，以滿足客(ke)戶多樣化的實驗需(xu)求。
? 載體全：多(duo)種(zhong)表達載(zai)體、多(duo)種(zhong)標簽(qian)載(zai)體和多(duo)種(zhong)報告基(ji)因(yin)可供客戶選擇。
? 貨期短：Human ORF cDNA克隆可在2-3天穿梭(suo)至其他標簽（3×Flag，Myc，Flag，HA，6×His，Flag & His，GFP，RFP等）的穿梭(suo)載體，個性化定(ding)做腺病毒；
? 純度高：采用改(gai)良的碘克砂醇密(mi)度(du)梯度(du)超(chao)速離心法進行(xing)腺病毒純(chun)化，對于動物沒有任何毒性；
? 服務優：可根據客戶具體實驗，由公司專業技術人員提供載體構建(jian)方(fang)案，提供特(te)殊定(ding)制服務。
[1]. Yoo, S.M. and Y.K. Jung, A Molecular Approach to Mitophagy and Mitochondrial Dynamics. Mol Cells, 2018. 41(1): p. 18-26.
[2]. Guan, R., et al., Mitophagy, a potential therapeutic target for stroke. J Biomed Sci, 2018. 25(1): p. 87.
[3]. Marwaha, R., et al., The Rab7 effector PLEKHM1 binds Arl8b to promote cargo traffic to lysosomes. J Cell Biol, 2017. 216(4): p. 1051-1070.
400-077-2566
service@wzbio.cn
