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2020諾獎出爐 ‖ 再次了解CRISPR/Cas9這個黑科技

CRISPR/Cas9系統

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 CRISPR/Cas系統是細菌和古細菌在長期演化過程中形成的一種適應性免疫防御，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR主要有兩類:第1類(包括第I、III、IV型)利用多種Cas蛋白，而第2類(第II、V、VI型)則需要單一Cas蛋白。這些Cas蛋白利用RNA引導靶向切斷并降解外來入侵DNA。哺乳動物細胞中常用的用于基因編輯的Cas酶包括II型化膿性鏈球菌(Sp)Cas9、略小的金黃色葡萄球菌(Sa) Cas9或V型Cas12a / Cpf1。在II型CRISPR系統中，crRNA與反式激活tracrRNA形成復合物(稱向導RNA，gRNA)，靶向Cas9蛋白從而切斷DNA中的特定位點。

 在哺乳動物細胞基因編輯應用中，gRNA中包含了一個與基因組DNA靶點互補(附近有一個前間區序列鄰近基序，簡稱PAM)的20 bp序列，它將Cas9蛋白定位到該位點，從而在DNA中產生雙鏈斷裂(DSB)。Cas9蛋白切割后產生的DSB主要通過兩種機制進行修復：一種是細胞內源性的非同源端連接修復機制(NHEJ)，可以導致小的插入或刪除(indels)，或通過同源定向修復(HDR)，添加外源性模板，產生新的DNA。（圖一）

圖1.CRISPR/Cas9基因編輯系統

1. spCas9 和 saCas9

根據PAM序列的不同，Cas9分為spCas9和saCas9兩種。（圖二）

 saCas9基因序列長約3.3kb，spCas9基因序列長約4.1kb，由于saCas9的基因序列要比spCas9的基因序列短很多，所以在克隆方面，saCas9要更為容易，且saCas9更適宜包裝成AAV病毒，兩者也都可以包裝成腺病毒和慢病毒。saCas9和spCas9另外一個很大的區別是兩者識別的PAM序列不同，saCas9識別的PAM序列是5’-NNGRRT-3’,而spCas9識別的PAM序列為5’-NGG-3’,因為saCas9的PAM序列要比spCas9的PAM序列長，在基因組中出現的概率更低，相比于spCas9脫靶率要低，其gRNA設計也相對更困難。

圖2.spCas9和saCas9

2. CRISPR/Cas9與ZFN和TALENs的比較

 CRISPR/Cas9是繼ZFN和TALENs之后的第三代基因編輯技術。與前兩代基因編輯技術相比，CRISPR/Cas9具有低成本、高效率和簡單易用等優勢，因而被人們廣泛應用。下表所列為ZFN、TALENs和CRISPR/Cas9三種基因編輯技術的比較。

特性	ZFN	TALENs	CRISPR/ Cas9
序列識別組分	蛋白-DNA	蛋白-DNA	RNA-DNA
靶向效率	特異性和效率低	特異性和效率較低	特異性和效率高
成本效率	成本高	成本較高	成本低
脫靶誘變	可變的	低	中等的
設計參數	蛋白	蛋白	RNA
病毒傳遞	容易	中等	中等

3. CRISPR /Cas9技術的應用

①基因功能篩選

利用慢病毒載體中建立單一的gRNA文庫并應用于哺乳動物細胞的基因功能分析，與現有的RNA干擾文庫比較，除了產生敲除而不是暫時敲除外，也降低了脫靶效應。 ②為診斷和基因治療創建細胞和動物模型

CRISPR/Cas9技術可精確地修改細胞和動物模型中的DNA，可能從單點突變到染色體易位，從而導致轉基因細胞系和動物系統的產生。這一應用不僅對診斷有效，而且對錯誤插入或缺失的糾正也有效，從而成為基因治療的一個重要方面。

③抗菌及抗病毒藥物應用

 研究表明，通過噬菌體傳遞針對細菌耐藥基因設計的CRISPR/ Cas9系統，有助于靶向耐藥候選菌。類似地，序列特異性抗病毒藥物也在開發中，可利用CRISPR/ Cas9技術修飾參與宿主-病毒相互作用的基因。

④在植物中的應用

 CRISPR/Cas9系統為植物基礎研究提供了寶貴的工具，也為作物改良提供了機會。CRISPR/Cas9系統可以很容易地對普通作物進行改造，有望成為植物育種的發展方向。水稻、小麥、玉米、番茄、蘋果、模范豆科植物、荷花、苜蓿等均已成功轉化。

維真CRISPR/Cas9特色產品

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①gRNA現貨質粒  ? 13000余個小鼠gRNA pool克隆和350余個人源gRNA pool克隆； ? 針對每個基因設計多條gRNAs，敲除概率大； ? 人源gRNA pool克隆均經過敲除效果驗證，效果有保障； ? 交貨時間短，次日發貨； ? 現貨供應。

小鼠和人源gRNA克隆所用質粒

②敲除細胞系

?160余種人源基因HEK293敲除細胞系；

?人源基因HEK293敲除細胞系比瞬時敲除效率更高，時間更長，效果更好；

?交貨時間短，敲除細胞系2周發貨；

維真CRISPR/Cas9特色服務

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維真生物可為科研工作者提供全套CRISPR/Cas9相關服務，包括gRNA的設計與篩選、gRNA/Cas9載體構建、gRNA/Cas9病毒包裝、敲除效果驗證以及KO細胞系的建立。

1. 服務項目全：維真生物可以提供從gRNA序列設計、gRNA質粒構建、高效gRNA序列篩選、病毒包裝和細胞系建立等多種靈活性服務，滿足科研工作者不同的實驗需求；

2. 服務種類多：維真生物可以提供單gRNA質粒構建，多合1 gRNA質粒構建和gRNA pool & gRNA mix質粒構建；

①4 gRNA mix質粒構建—— 保證有效 & 選擇性多

 該服務是將4條gRNA序列克隆至Cas9 + gRNA all in one慢病毒質粒。該重組質粒不僅可以用于轉染細胞，也可包裝成慢病毒。但是，考慮到重組載體比較大對細胞轉錄效率的影響，我們強烈推薦您直接選擇慢病毒成品。

②gRNA pool質粒構建—— 編輯效率大大提高

 維真生物采用特殊的生產工藝針對同一基因構建gRNA pool質粒，大大提高了目的基因的編輯效率。

3. 質粒數量多：維真生物可以提供單載體、雙載體；腺病毒載體、慢病毒載體和AAV 載體；不同報告基因EGFP和RFP，不同真核抗性篩選基因puro和Blat、cre功能基因質粒。

維真CRISPR/Cas9相關載體（部分）

腺病毒載體
……
慢病毒載體
……
AAV載體
……

4. 效果有保障：

維真生物建立了一套簡捷和可重復的基因敲除效果檢測系統——熒光法，克服了常規檢測方法的弊端，操作簡單、周期短、敲除效果檢測不受細胞類型的限制、實驗結果直觀可靠！

設計策略如下：

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參考文獻及客戶代表性文獻

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參考文獻：

 [1]. Young, C.S., A.D. Pyle and M.J. Spencer, CRISPR for Neuromuscular Disorders: Gene Editing and Beyond. Physiology (Bethesda), 2019. 34(5): p. 341-353.

 [2]. Gupta, D., et al., CRISPR-Cas9 system: A new-fangled dawn in gene editing. Life Sci, 2019. 232: p. 116636.

客戶代表性文獻：

 1. Science Advances. (IF=13.116). Sun, et.al. (2020). Development of a CRISPR-SaCas9 system for projection- and function-specific gene editing in the rat brain.［北京大學 CRISPR-saCas9 基因編輯雄性SD大鼠特定神經元群］；

 2. Int. J. Mol. Sci. (IF=4.556). Xu, et al. (2020). Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle.［上海交通大學 AdV-CRISPR system(pAdM-U6-gRNA1-U6-gRNA2-CMV-spCas9) 雞胚成纖維細胞DF-1 MOI=1000 & 雞肌肉注射 雞骨骼肌的生長和發育］；

 3. Retrovirology. (IF=4.183). Wang, et.al. (2017). Genome modifcation of CXCR4 by Staphylococcus aureus Cas9 renders cells resistance to HIV-1 infection.［武漢大學基礎醫學院 AAV-SaCas9-CXCR4-gRNA HIV基因治療］。