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多發性硬化（Multiple sclerosis，MS）是一種慢性神經炎性疾病，伴有脊髓脫髓鞘和神經退行性病變，多發于年輕人中。臨床癥狀多種多樣，常見的有肢體無力、感覺異常、視力下降及精神異常等，但MS的病理機制尚不完全清楚。目前，免疫系統的失調被廣泛認為是MS發生和發展的因素。
近期，Molecular Medicine在線發表了題為“LRRC4 functions as a neuron-protective role in experimental autoimmune encephalomyelitis”的論文，揭示了LRRC4在實驗性自身免疫性腦脊髓炎中對神經元的保護作用，為脊髓疾病機理研究提供了新的見解，并提出了治療MS的新策略。
富含亮氨酸重復序列4（LRRC4）是LRR蛋白家族的成員，也稱作NGL-2，可以調節興奮性突觸的形成，并促進神經元的軸突分化。已有研究表明，人類LRRC4基因突變與自閉癥譜系障礙（ASD）和智力殘疾有關，且LRRC4可作為抑癌基因抑制膠質瘤細胞等的增殖，但是在脊髓相關疾病中LRRC4是否發揮作用尚不清楚。免疫系統的失調被廣泛認為是MS的啟動和發展的因素，Treg細胞在MS發病機制中發揮重要作用，調節Th細胞分化可能是MS診斷和治療的潛在策略，本研究通過建立免疫發病機制與MS相似的EAE小鼠模型研究LRRC4對脊髓相關疾病的影響。
首先，研究者確定了LRRC4主要在脊髓神經元中表達，并利用EAE小鼠模型檢測發病過程中LRRC4在脊髓中的表達情況；然后構建LRRC4缺失（LRRC4-/-）型小鼠并對其進行EAE誘導，進行神經功能和體重評估的同時使用染色和免疫組織化學法探究脊髓的病理變化，分析LRRC4對脊髓神經元的保護作用。接著，研究者通過測定脊髓炎癥相關細胞因子的表達，并利用RNA-seq分析WT與LRRC4-/-小鼠中的差異表達基因，探究了LRRC4參與EAE發病的分子機制；又通過流式細胞術檢測脾臟和血液的免疫細胞因子水平以評估LRRC4缺失是否對EAE發展過程中輔助T細胞群造成影響，最后研究者使用腺相關病毒對LRRC4進行過表達（AAV-LRRC4），觀察AAV-LRRC4異位表達對EAE的治療作用。
| 基因 | 腺相關病毒產品 | 注射方式 | 劑量 |
|---|---|---|---|
| 富含亮氨酸重復序列4（LRRC4） |
|
尾靜脈注射 | 5×1012vg/kg |
首先，研究者使用免疫熒光染色法測定了正常小鼠的神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞中LRRC4的表達，發現LRRC4主要在神經元中表達。免疫組織化學染色也證實了LRRC4在大腦皮層、海馬或脊髓的神經元中表達。接著，研究者使用髓鞘少突膠質細胞糖蛋白（MOG35-55）誘導EAE小鼠并對脊髓中LRRC4的表達進行檢測，發現EAE小鼠脊髓中LRRC4 mRNA與蛋白表達量均降低，但在大腦中未檢測到差異，提示MOG35-55誘導脊髓神經元LRRC4表達下調，并參與了EAE小鼠的發病過程。
考慮到MOG35-55是由于脫髓鞘而誘發EAE，因此研究者猜測在EAE進程中LRRC4是否在脊髓發揮神經保護作用。通過構建LRRC4缺失（LRRC4-/-）小鼠，并對其以及WT小鼠進行EAE誘導，發現LRRC4的缺失加重了脊髓的損傷程度和脊髓脫髓鞘，淋巴細胞加速向脫髓鞘病變部位募集。以上結果表明，LRRC4在EAE過程中起到保護神經元的作用。
鑒于EAE誘導的LRRC4-/-小鼠的中樞神經系統中淋巴細胞濃度較高，因此推測LRRC4-/-小鼠脊髓中促炎因子的水平要高于正常小鼠，為驗證這一猜想研究者測定了各種細胞因子的水平，發現LRRC4缺失導致脊髓炎癥反應升高和EAE發病機制惡化。接著研究者剖析了潛在的分子機制，檢測了在炎癥和EAE發病機制中作用已得到證實的NF-κB、ERK/MAPK和PI3K/AKT信號通路相關因子NF-κB, p-AKT和p-ERK1/2在正常和EAE狀態下LRRC4-/-小鼠和WT小鼠中脊髓中的水平，發現LRRC4缺失誘導NF-κB的上調和脊髓炎癥相關細胞因子水平的改變，提示這可能是EAE加速發展的原因之一。
為進一步探究LRRC4參與EAE發病的分子機制，研究者應用RNA-seq來闡明LRRC4缺失后小鼠脊髓的轉錄基因變化并進行差異表達基因（DEG）的分析。發現上調的DEGS的KEGG通路與肌萎縮側索硬化癥有關，其中小G蛋白Rab7b上調非常明顯，且它已被證實可以激活NF-κB并能促進IL-6的產生。通過檢測Rab7b的表達，研究者發現LRRC4-/-小鼠中Rab7b的mRNA和蛋白質水平均高于WT小鼠，且EAE小鼠脊髓中Rab7b mRNA表達增強，且與LRRC4呈負相關，這增加了Rab7b參與EAE發病的可能性。
為確定LRRC4、Rab7b與NF-κB之間的聯系，研究者在分離的LRRC4+/+和LRRC4?/?小鼠的神經元中檢測了Rab7b和NF-κB p65的表達，發現兩者在LRRC4?/?小鼠神經元中表達上調，且外源表達LRRC4后兩者水平均降低。通過RNAi干擾Rab7b后，在LRRC4+/+小鼠神經元中表現為NF-κB p65表達量下降，LRRC4?/?小鼠中未見下降，而當Rab7b與LRRC4共轉染時，NF-κB p65表達顯著降低。這說明，Rab7b能在LRRC4存在的情況下調節NF-κB，提示Rab7b可能是LRRC4在NF-κB調控中的下游效應因子。
研究者先前研究已證明，在膠質母細胞瘤細胞中LRRC4可導致NF-κB活化，并產生IL-6、CCL2和IFN-γ。而IL-6誘導T細胞分化成Teff細胞，而非Treg細胞。EAE小鼠伴有強烈的髓鞘特異性自身免疫反應，而LRRC4的缺失導致更嚴重的髓鞘變性，因此推測LRRC4?/?可能引起更嚴重的免疫反應。為此研究者對LRRC4缺失是否會導致EAE發展過程中輔助T細胞群體的改變進行了探究。使用流式細胞儀測定免疫15 d后小鼠的脾臟和血液中細胞因子的比例，發現LRRC4缺失未改變正常小鼠脾臟和血液Th1細胞的比例，但卻增加了EAE小鼠中Th1細胞的比例。進一步對Treg細胞分析發現，LRRC4?/?的EAE小鼠脾臟中的Treg細胞明顯減少，這說明，LRRC4缺失導致了Th1免疫反應，免疫調節功能減弱，這可能加速了EAE的進程。
在證明了LRRC4在EAE小鼠中表達下調，并且LRRC4缺失會加劇EAE進程后，研究者猜測異位表達LRRC4是否可以修復EAE的病理缺陷。因此，使用腺相關病毒（AAV-LRRC4）對小鼠進行過表達LRRC4處理，注射10 d后用MOG35-55誘導EAE并進行臨床評分以及組織染色研究。結果表明LRRC4的過表達減緩了EAE的進程，同時也減輕了EAE引起的脫髓鞘和自身免疫缺陷。因此，研究者提出AAV-LRRC4病毒可能被用作治療MS患者的治療工具，為MS疾病的治療提供新的方法。
本研究證實了LRRC4在EAE中的關鍵作用，EAE小鼠脊髓中LRRC4表達減少。LRRC4主要在神經元中表達，并在EAE小鼠中發揮保護神經元作用；LRRC4缺失后會加劇脫髓鞘、神經元損傷和神經炎癥，NF-κB p65升高，p-AKT降低，導致IFN-γ和IL-6上調，IL-10、TNF-α和TGF-β下調，導致Th1細胞增加和Treg細胞減少。外源增加LRRC4的表達可能為防止EAE惡化和治療提供新的治療策略，并可作為MS輔助支持治療的潛在靶點。
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