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AAV-PCSK9讓你的動脈粥樣硬化造模更簡單！

1. 動脈粥樣硬化簡介

目前，心腦血管疾病在人群中的發病率越來越高，其發病基礎主要是動脈粥樣硬化（atherosclerosis,AS）。動脈粥樣硬化是一種慢性進行性疾病，發病機理非常復雜，目前尚未明了，有多種學說從不同角度來闡明，諸如脂肪浸潤學說、血栓形成和血小板聚集學說、損傷反應學說和克隆學說等，近年來，內皮損傷學說逐漸被公認。即多種因素使內皮細胞受損，使動脈內膜的完整性受到破壞，加上脂質代謝紊亂，血液中的脂蛋白從受損的內皮細胞進入動脈壁，引起平滑肌細胞的增生，隨著脂質的不斷沉積和平滑肌細胞的持續增生，并經過一系列復雜的連鎖反應和惡性循環形成動脈硬化。盡管現代醫學的不斷發展為其治療提供了很多選擇，但它仍然是世界范圍內的造成死亡的主要原因之一，因此，研究動脈粥樣硬化的發病機制及其影響因素尤為重要。

2. PCSK9簡介及其在動脈粥樣硬化中的作用

PCSK9（proprotein convertase subtilisin/kexin type 9），前蛋白轉化酶枯草溶菌素轉化酶9，kexin樣前轉化酶枯草桿菌蛋白酶家族的第九個成員，定位于1p32.3染色體，由692個氨基酸組成，是脂質穩態的一個關鍵調控因子。PCSK9屬于細胞內“轉化酶”或脫羧酶, 在嚙齒類動物中，PCSK9主要在成年肝細胞中表達，在小腸和腎臟中表達較少，在發育中的中樞神經系統中短暫表達；在成人中，PCSK9主要在肝臟中表達, 在小腸、腎臟、腦等中也有少量表達。研究表明，PCSK9在內皮細胞，血管平滑肌細胞和巨噬細胞中有較高水平的表達，對血管穩態和動脈粥樣硬化斑塊產生局部影響。

肝臟是脂蛋白轉運和代謝的主要部位，肝細胞通過低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor, LDLR）的主要調節因子PCSK9來控制血液中的低密度脂蛋白（LDL）水平。PCSK9由肝臟分泌到血漿中，與肝細胞表面的LDLR結合，構成復合物并靶向轉運到溶酶體內進行降解, 從而阻斷LDLR在細胞膜表面的循環途徑, 使得血漿中LDL升高, 最終導致動脈粥樣硬化。此外，PCSK9還會誘導炎癥細胞因子、粘附分子和趨化劑的表達，從而增加單核細胞的募集、炎癥細胞的粘附和動脈粥樣硬化血管壁的炎癥。目前，PCSK9已經成為降脂藥物研發及動脈粥樣硬化干預的熱門靶點。

圖1. PCSK9與肝細胞LDLR結合
（Alkindi M, Siminovitch KA,et al. Can J Cardiol, 2016）

3. AAV-PCSK9 造模方法

動脈粥樣硬化模型對于我們了解疾病的發病機制，并開發其治療方法具有重大意義。目前，載脂蛋白E缺陷（ApoE-/-）和低密度脂蛋白受體缺陷（LDLR-/-）小鼠是應用比較廣泛的動脈粥樣硬化小鼠模型，但是，這些通過生殖系基因工程技術在小鼠內建立的模型需要復雜而耗時的回交。近年來，科學家建立了一種快速、簡便、通用和經濟有效的無種系遺傳工程的建模方法：單次靜脈注射AAV-PCSK9DY。

 PCSK9的功能獲得性突變PCSK9DY可以誘發高膽固醇血癥，研究表明，PCSK9DY與 LDLR的體外親和性相比野生型 PCSK9至少高出10倍， 其誘發高膽固醇血癥的作用更強。為了實現長期的高膽固醇血癥，研究者將不同劑量的重組腺相關病毒載體（人源及小鼠PCSK9DY載體設計圖見圖2）注射至C57BL/6NTac小鼠中，然后進行高脂飲食，12周后，小鼠出現動脈粥樣硬化，主要表現在主動脈弓或主動脈根（圖3）。

圖2. PCSK9DY載體示意圖

圖3. AAV-PCSK9DY誘導小鼠動脈粥樣硬化
（Bjorklund，M .M ., et al. Circulation Research, 2014）

4. 維真AAV-PCSK9應用實例

“Smooth muscle-specific HuR knockout induces defective autophagy and atherosclerosis ”

人類抗原R(Human antigen R，HuR)是一種廣泛存在的RNA結合蛋白，參與多種疾病的動態調節和病理過程，但是其在AS中的作用尚不明確。在這項研究中，作者建立了平滑肌特異性HuR基因敲除的小鼠模型(HuRsmko)，以研究HuR在動脈粥樣硬化中的作用。發現HuR在動脈粥樣硬化斑塊中的表達降低，與對照組相比，HuRsmko小鼠在動脈粥樣硬化模型中顯示出更多的斑塊。HuR能與AMPKα1和AMPKα2結合，增加其穩定性和蛋白表達。HuR缺乏降低了p-AMPK和LC3II水平，增加了p62水平，從而導致自噬缺陷。而藥理學AMPK激活誘導HuRsmko小鼠的自噬并抑制動脈粥樣硬化。本研究表明，平滑肌HuR可以通過增加AMPK介導的自噬，對動脈粥樣硬化起到保護作用。

為研究HuR在AS中的作用機制，研究人員構建了平滑肌特異性HuR基因敲除（HuRsmko）小鼠模型，然后注射rAAV/D377Y-mPCSK9載體并喂食Paigen飼料12周以誘導動脈粥樣硬化。發現HuRsmko小鼠的動脈粥樣硬化表面病變比例明顯高于對照組，且主動脈根病變面積顯著增加。同時，HuR的缺失增加了巨噬細胞的積累和基質金屬酶2（MMP2）的水平，降低了膠原含量，表明VMSC中HuR的缺失促進了動脈粥樣硬化的發展（圖4）。

圖4. 平滑肌細胞中HuR缺失加重動脈粥樣硬化

5. 維真AAV-PCSK9現貨供應

 隨著研究的不斷深入，PCSK9腺相關病毒注射配合高脂高膽固醇飲食，已經逐漸成為動脈粥樣硬化的理想造模方式。

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6. AAV-PCSK9參考文獻

 1. Seidah N G , Awan Z , Chretien M , et al. PCSK9: a key modulator of cardiovascular health.[J]. Circulation Research, 2014, 114(6):1022-1036.

 2.Alkindi M, Siminovitch KA, Gupta M, et al.Monoclonal antibodies for the treatment of hypercholesterolemia:targeting PCSK9[J].Can J Cardiol, 2016, 32 (12) :1552-1560.

 3.Bjorklund M M , Hollensen A K , Hagensen M K , et al. Induction of atherosclerosis in mice and hamsters without germline genetic engineering.[J]. Circulation Research, 2014, 114(11):1684-1689.

 4.Liu S , X Jiang, X Cui, et al. Smooth muscle-specific HuR knockout induces defective autophagy and atherosclerosis[J]. Cell Death & Disease, 2021, 12(4):385.