腺病毒-PB轉座系統
眾所周知，慢病毒(du)載體(ti)作(zuo)為基(ji)因(yin)(yin)傳(chuan)遞的(de)工具很大(da)(da)一(yi)個優(you)勢(shi)就是(shi)具有整合(he)特性(xing)，非(fei)常適合(he)構(gou)建穩(wen)(wen)(wen)轉細胞株，但(dan)包裝容量小、病毒(du)滴(di)度低(di)也是(shi)限制(zhi)它大(da)(da)顯身手的(de)弊端所在，因(yin)(yin)此只(zhi)適合(he)常規基(ji)因(yin)(yin)，而無法實現較(jiao)大(da)(da)基(ji)因(yin)(yin)的(de)穩(wen)(wen)(wen)轉株構(gou)建。而AAV雖然是(shi)體(ti)內研究的(de)理想載體(ti)，但(dan)由(you)于載體(ti)容量等原因(yin)(yin)也無法實現較(jiao)大(da)(da)基(ji)因(yin)(yin)在體(ti)內的(de)長期穩(wen)(wen)(wen)定表達。因(yin)(yin)此，開發一(yi)種新的(de)基(ji)因(yin)(yin)傳(chuan)遞工具對于較(jiao)大(da)(da)基(ji)因(yin)(yin)的(de)體(ti)內外研究至(zhi)關重要。
腺病毒包裝容量大，幾乎能感染所有類型的細胞，容易制得高滴度的病毒，而且非常適合體內外研究，因此利用腺病毒來制備穩轉株并實現基因在體內的長期穩定表達，可能是開發這一新型工具的重要突破口。然而，腺病毒感染細胞只能實現基因的瞬時表達，單從這一點考慮，恐難實現。如何才能發揮其長處，彌補其短板，是需要攻克的難點。
Gene delivery
這不，最近小編聽說，腺病毒已經“拓展業務”跑來做穩轉株了，這是怎么回事兒？原來，腺病毒深化了對外交往，與PiggyBac（PB）轉座子開展了合作。我們知道，PB轉座子是研究基因功能,制備轉基因動物及基因治療的優良載體，具有廣泛宿主譜，通過“剪切-粘貼”機制介導外源基因的穩定整合與表達。但其目前應用的主要方式仍是通過質粒轉染，而質粒載體本身存在轉導效率低、非整合等弊端。因此，本次腺病毒與PB的合作將是值得萬眾期待的。
腺病毒與(yu)PiggyBac（PB）強強聯合
一、轉座(zuo)子系(xi)統介紹
轉座子又稱跳躍因子，是基因組中一段可移動的DNA序列，它們可以直接從基因組的一個位點“跳躍”到另一個位點，轉座子發生位置轉移的過程即為轉座。轉座子載體系統轉座時可攜帶一段外源DNA序列，從而實現目的基因的轉移。根據轉座機制的不同，可將轉座子分為兩大類：逆轉錄轉座子和DNA轉座子。逆轉錄轉座子以RNA為媒介進行轉座，采用“復制-粘貼”機制，即先將自身DNA轉錄形成RNA中間產物, 再逆轉錄產生新的DNA拷貝,最后插入基因組的其他位置實現轉座, 而原位點的轉座子保持不變。DNA轉座子則以DNA為媒介進行轉座，采用“剪切-粘貼”轉座機制，在轉座酶的作用下, 轉座子從原位置切除下來并整合到新的位點。DNA轉座子相對逆轉錄轉座子而言，轉座效率高，易被人為改造，因而應用較為廣泛，其具體轉座機制如圖1。
圖(tu)1. DNA轉(zhuan)座子(zi)轉(zhuan)座機制示意圖(tu)
野生型的(de)DNA轉座(zuo)(zuo)子中(zhong)(zhong)通常(chang)含(han)有轉座(zuo)(zuo)酶(mei)編(bian)碼序(xu)列，轉座(zuo)(zuo)酶(mei)通過(guo)識(shi)別轉座(zuo)(zuo)子兩端(duan)(duan)的(de)ITR（反向(xiang)末端(duan)(duan)重復(fu)序(xu)列），介(jie)導轉座(zuo)(zuo)子發(fa)生轉移。經(jing)人工改(gai)造后，中(zhong)(zhong)間的(de)轉座(zuo)(zuo)酶(mei)編(bian)碼序(xu)列可被其它外源DNA序(xu)列所替換，在(zai)細(xi)胞中(zhong)(zhong)轉座(zuo)(zuo)酶(mei)存在(zai)的(de)情(qing)況下發(fa)生轉座(zuo)(zuo)，從(cong)而將(jiang)外源DNA插入基(ji)因組中(zhong)(zhong)，實現轉基(ji)因操作。
圖(tu)2. DNA轉座子實(shi)現(xian)轉基因操作的機制示意圖(tu)
A:野生(sheng)型DNA轉座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi) B:人工修飾的轉座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)載體 C:轉座(zuo)(zuo)(zuo)酶表達載體
目前，已(yi)在真核生物(wu)中發現(xian)數10種DNA轉座子，具體分類(lei)和特(te)征如下：
圖3. 真核(he)生物DNA轉座(zuo)子分類
轉座子可以在基因組任意位置插入和切除，常用于哺乳動物細胞基因編輯研究中。目前發現的可用于哺乳動物基因轉移的DNA轉座子系統主要有3類：類hAT轉座子Tol 2，兩個類Tc1轉座子Sleeping Beauty ( SB) 和 Frog Prince ( FP)，Piggy Bac超家族成員Piggy Bac（PB）。其中，PB轉座系統憑借其轉座效率高，宿主范圍廣等優勢，近年來已在哺乳動物細胞中得到了廣泛的應用，也是本文的介紹重點。
二(er)、PB轉(zhuan)座(zuo)系統
1、結構特點(dian)
PB轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)子屬于(yu)DNA型(xing)轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)子，全長2476 bp。PB轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)子末端(duan)為長13 bp的反向重(zhong)復序列（ITRs），在其(qi)內部不對稱分布有19 bp的亞(ya)末端(duan)反向重(zhong)復序列（sub-ITRs），sub-ITRs中間有一個(ge)1.8 kb的開(kai)放(fang)閱讀框(kuang)，編碼594個(ge)氨基酸的piggyBac轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)酶，分子量為64 kDa，該轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)酶是轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)子轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)過程所必需(xu)的。
圖4. PB轉(zhuan)座子的結構示意圖
2、轉座模式
PB轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)(zi)(zi)的(de)轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)(zuo)遵循“剪切(qie)-粘(zhan)貼”機制，在(zai)哺乳動物細(xi)(xi)胞(bao)(bao)基因組DNA中靶向(xiang)TTAA序列(lie)。當piggyBac轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)(zuo)酶(mei)蛋(dan)白在(zai)哺乳動物細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中表達時(shi)，它會(hui)與(yu)轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)(zi)(zi)的(de)反向(xiang)重復序列(lie)結(jie)合，切(qie)割DNA并(bing)釋(shi)放(fang)轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)(zi)(zi)兩端(duan)的(de)3’-OH，3’-OH攻擊互補鏈(lian)5’端(duan)的(de)TTAA序列(lie)并(bing)形成發夾結(jie)構，從(cong)而(er)將轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)(zi)(zi)從(cong)質粒主(zhu)鏈(lian)中釋(shi)放(fang)出來(lai)(lai)，斷裂的(de)質粒主(zhu)鏈(lian)會(hui)在(zai)DNA連(lian)接(jie)酶(mei)的(de)作(zuo)用下重新連(lian)接(jie)起(qi)來(lai)(lai)而(er)不留下任何痕跡。與(yu)此同時(shi)，目標染(ran)(ran)(ran)色體(ti)的(de)特定(ding)位點（TTAA位點）被(bei)剪切(qie)為粘(zhan)性末端(duan)雙鏈(lian)斷口，切(qie)下的(de)PB轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)(zi)(zi)在(zai)PB酶(mei)的(de)作(zuo)用下連(lian)入(ru)被(bei)切(qie)開的(de)目標染(ran)(ran)(ran)色體(ti)中并(bing)把粘(zhan)性末端(duan)補平，從(cong)而(er)導(dao)致被(bei)插入(ru)目標染(ran)(ran)(ran)色體(ti)的(de)轉(zhuan)(zhuan)座(zuo)(zuo)(zuo)子(zi)(zi)(zi)兩側(ce)都存在(zai)TTAA。
在大(da)多(duo)數應(ying)用中，piggyBac轉(zhuan)(zhuan)座酶和piggyBac轉(zhuan)(zhuan)座子(zi)分別由(you)兩個單(dan)獨的(de)(de)質粒攜帶(dai)，通過(guo)瞬(shun)時(shi)轉(zhuan)(zhuan)染的(de)(de)方式(shi)導入(ru)細胞(bao)，因(yin)而會逐漸丟(diu)失(shi)，轉(zhuan)(zhuan)座酶的(de)(de)丟(diu)失(shi)使(shi)轉(zhuan)(zhuan)座子(zi)在宿(su)主(zhu)基因(yin)組(zu)(zu)中實(shi)現永久整合。當細胞(bao)中再次表達PB轉(zhuan)(zhuan)座酶時(shi)，會把轉(zhuan)(zhuan)座子(zi)從宿(su)主(zhu)基因(yin)組(zu)(zu)上切除，使(shi)宿(su)主(zhu)基因(yin)組(zu)(zu)恢復原狀，序列不會發生任何改變，這稱為“無(wu)縫(feng)切除”。
圖5. PB轉座子的作用(yong)機(ji)制
3、優勢
①轉座效率高。 PB轉座系統靶向于基因組的TTAA位點，而在基因組中TTAA序列出現較為頻繁，平均每246 bp便會出現一個TTAA位點。
②裝載容量大。PB轉座系統攜帶的外源片段可長達幾十Kb。
③可介導外源基因的穩定整合和表達。
④插入位置易(yi)檢測(ce)。可利用反式PCR方法迅速而精確地進行突變位點的檢測。
⑤可(ke)以實現“無縫(feng)切(qie)除”。轉座酶的再次表達可將導入的外源基因切除, 而不影響內源基因的表達。
三、腺病毒與轉座子聯手，助力體(ti)內外研究
在實際應用過程中，轉座酶和轉座子分別被構建在兩個載體上，而后導入細胞。無論是質粒組還是腺病毒組，添加轉座酶組細胞存活數量要遠遠多于未添加組，說明轉座酶在轉座過程中的必需性；而腺病毒組細胞存活數量整體多于質粒組，說明腺病毒轉座體系的效率更強。（圖A、B為質粒轉座體系，圖C、D為腺病毒轉座體系）
質粒轉(zhuan)座(zuo)子體系 pk 腺(xian)病毒轉(zhuan)座(zuo)子體系
1、腺病毒(du)轉(zhuan)座體系較(jiao)質(zhi)粒(li)轉(zhuan)座體系效率更高
首先，我們將(jiang)PB轉座(zuo)(zuo)子(zi)(zi)和(he)轉座(zuo)(zuo)酶(mei)分別(bie)構建至腺(xian)(xian)病毒(du)載體并(bing)包裝腺(xian)(xian)病毒(du)，分別(bie)通(tong)過質(zhi)粒(li)和(he)病毒(du)感(gan)染(ran)兩種方式(shi)處理A549細胞(bao)。發現，質(zhi)粒(li)轉染(ran)48小時，Puro加壓7天后(hou)，加轉座(zuo)(zuo)酶(mei)組細胞(bao)大(da)量存活，而對(dui)照(zhao)組細胞(bao)幾乎全部凋(diao)亡(wang)。腺(xian)(xian)病毒(du)感(gan)染(ran)48小時，Puro加壓兩周(zhou)后(hou)，加轉座(zuo)(zuo)酶(mei)組細胞(bao)穩轉擴(kuo)增，對(dui)照(zhao)組細胞(bao)逐漸凋(diao)亡(wang)（如下(xia)圖所示(shi)）。這說明，轉座(zuo)(zuo)酶(mei)在(zai)轉座(zuo)(zuo)子(zi)(zi)轉座(zuo)(zuo)過程(cheng)是(shi)必需(xu)的，且腺(xian)(xian)病毒(du)轉座(zuo)(zuo)子(zi)(zi)比(bi)質(zhi)粒(li)轉座(zuo)(zuo)子(zi)(zi)轉座(zuo)(zuo)效率更(geng)高。
質粒組(zu)與病毒組(zu)實驗結果
2、腺病毒-PB轉(zhuan)座體系效率分析
為評估(gu)腺病毒(du)-PB轉座體系的轉座效率，我(wo)們(men)對腺病毒(du)組存(cun)活細胞數量進行(xing)了(le)分(fen)析。計數與染色結果顯示(shi)，加轉座酶組的存(cun)活細胞數量是(shi)未加轉座酶組的近33倍（如下(xia)圖所示(shi)）。
腺病毒(du)組存活細胞數分析
結語
腺病毒與PiggyBac轉座系統的融合，既可進行細胞的高效感染，又可實現外源基因在宿主細胞的穩定整合與表達。因此，如果您有基因的穩轉需求，無論是常規基因還是較大基因，常規細胞還是難感染的細胞，體內研究還是體外研究，都可以優先選擇腺病毒-PB轉座體系。利用這一體系可以完美地解決穩轉株構建以及外源基因在動植物體、組織中穩定表達的難題，尤其是對那些較大基因來說，這一體系尤其適用，歡迎各位老師咨詢訂購！
維真生物腺病毒-PB轉座系統部分載體
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載體名稱
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啟動子
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抗生素(su)
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熒光(guang)蛋(dan)白
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pADM-PB-CMV-EGFP-mCMV-Puro
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CMV
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Puro
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GFP
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pADM-PBase
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CMV
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參考文獻
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