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2016年，科學家發現了可以靶向RNA進行切割的CRISPR/Cas13系統，該系統由單一的效應蛋白Cas13和CRISPR RNA（crRNA）組裝形成一個由crRNA引導的RNA靶向效應復合物。目前，Cas13家族共鑒定(ding)出四種亞型(xing)，包(bao)括Cas13a（又名C2c2）、Cas13b、Cas13c和Cas13d，四種Cas13亞型(xing)蛋(dan)白分子量均小于(yu)Cas9蛋(dan)白。所有Cas13蛋白(bai)均具有兩種不同的(de)催化活(huo)性(xing)(xing)：①由兩個(ge)較高等的(de)真核(he)(he)和(he)原(yuan)核(he)(he)核(he)(he)苷酸結合（Higher eukaryotes and prokaryotes nuceotide-binding，HEPN）結構域(yu)提供的(de)RNase活(huo)性(xing)(xing)，這是靶(ba)RNA降解(jie)所必需(xu)的(de)。Cas13 四個(ge)亞型同源性(xing)(xing)較低，且同源序列(lie)僅限于HEPN結構域(yu)位點(dian)，此外兩個(ge)HEPN結構域(yu)中(zhong)的(de)單點(dian)突變會使CRISPR/Cas13系統對RNA的(de)切割(ge)能力完全喪失；②催化pre-crRNA加(jia)工(gong)和(he)形成成熟crRNA的(de)RNase活(huo)性(xing)(xing)。

圖1. VI CRISPR/Cas系(xi)統結構示(shi)意圖

與CRISPR II類系(xi)(xi)統(tong)的(de)其它核(he)酸(suan)酶結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)一致，Cas13a的(de)整體(ti)結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)是雙葉(xie)的(de)，N-末端結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)域（N-terminal domain，NTD）和(he)Helical-1結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)域構(gou)(gou)成(cheng)crRNA識別葉(xie)（REC lobe），HEPN1、Helical-2、HEPN2結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)域形成(cheng)核(he)酸(suan)酶葉(xie)（NUC lobe）（圖(tu)2）。CRISPR/Cas13b系(xi)(xi)統(tong)有兩(liang)種酶，分別是VI-B1和(he)VI-B2，它們之間的(de)區別在(zai)于Cas13b轉座子上攜(xie)帶的(de)附屬蛋(dan)白(bai)(bai)的(de)基因(yin)型不同，VI-B1的(de)附屬蛋(dan)白(bai)(bai)是Csx28，而VI-B2的(de)附屬蛋(dan)白(bai)(bai)是Csx27。絕大多數Cas13d型系(xi)(xi)統(tong)還含(han)有包含(han) WYL結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)域的(de)相關(guan)(guan)輔助蛋(dan)白(bai)(bai)，WYL結(jie)(jie)(jie)(jie)(jie)構(gou)(gou)域通常與原(yuan)核(he)防御系(xi)(xi)統(tong)有關(guan)(guan)（圖(tu)1）。

圖2. Cas13a蛋白(bai)結構域示意圖

所有的(de)(de)Cas13蛋白(bai)酶都需要(yao)60- 66 nt的(de)(de)crRNA來(lai)確保靶向特(te)異性。四(si)種亞型crRNA都有一個(ge)促進與相應(ying)Cas13蛋白(bai)酶結合的(de)(de)直接重(zhong)復（Direct repeat，DR）以及特(te)異性靶向轉錄(lu)本的(de)(de)間隔(ge)序(xu)列。Cas13b的(de)(de)crRNA在(zai)3’端攜帶直接重(zhong)復，而(er)Cas13a、c和(he)d的(de)(de)crRNA在(zai)5’端攜帶直接重(zhong)復（圖3）。

圖(tu)3. 四種(zhong)Cas13亞型對應的(de)crRNAs結(jie)構示(shi)意圖(tu) 

CRISPR/Cas13系(xi)統的(de)(de)(de)(de)防御(yu)機制主要(yao)包括以下幾個(ge)階段(duan)（以Cas13a為(wei)例）：①pre-crRNA 的(de)(de)(de)(de)識(shi)別與(yu)(yu)結(jie)合(he)(he)。新轉錄的(de)(de)(de)(de)pre-crRNA通過crRNA的(de)(de)(de)(de)5’端莖環結(jie)構與(yu)(yu)Cas13a的(de)(de)(de)(de)REC葉識(shi)別并(bing)結(jie)合(he)(he)，形(xing)成(cheng)(cheng)pre-crRNA與(yu)(yu)Cas13a復(fu)合(he)(he)物(wu)的(de)(de)(de)(de)中間(jian)過渡(du)態(tai)；②成(cheng)(cheng)熟(shu)crRNA的(de)(de)(de)(de)形(xing)成(cheng)(cheng)。NUC區(qu)的(de)(de)(de)(de)Helical-1和HEPN2結(jie)構域(yu)之間(jian)保守殘(can)基(ji)的(de)(de)(de)(de)構象(xiang)發(fa)生變化(hua)，從而形(xing)成(cheng)(cheng)一個(ge)酸堿催化(hua)中心，催化(hua)酶(mei)切pre-crRNA形(xing)成(cheng)(cheng)成(cheng)(cheng)熟(shu)的(de)(de)(de)(de)crRNA。此時的(de)(de)(de)(de)crRNA-Cas13a復(fu)合(he)(he)物(wu)處(chu)于無酶(mei)切活(huo)(huo)性狀態(tai)；③crRNA-Cas13復(fu)合(he)(he)物(wu)酶(mei)切活(huo)(huo)性的(de)(de)(de)(de)激(ji)活(huo)(huo)。靶ssRNA進入crRNA-Cas13a復(fu)合(he)(he)物(wu)內與(yu)(yu)crRNA發(fa)生堿基(ji)互(hu)補配對，誘發(fa)Cas13a發(fa)生構象(xiang)變化(hua)，從而激(ji)活(huo)(huo)crRNA-Cas13a復(fu)合(he)(he)物(wu)的(de)(de)(de)(de)酶(mei)切活(huo)(huo)性；④靶RNA的(de)(de)(de)(de)降解。在crRNA的(de)(de)(de)(de)引導(dao)下，Cas13a的(de)(de)(de)(de)HEPN結(jie)構域(yu)催化(hua)靶ssRNA的(de)(de)(de)(de)酶(mei)切。

有時(shi)細(xi)菌細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)會出現非特異(yi)性(xing)酶切的(de)情況，導致細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)其他附屬(shu)ssRNA的(de)降解，引起一定的(de)細(xi)胞毒性(xing)，但這種現象在哺乳動物細(xi)胞中(zhong)(zhong)(zhong)并未出現，其原(yuan)因目前尚未可知。（圖(tu)4）。

圖(tu)4. CRISPR/Cas13系統(tong)作(zuo)用機(ji)制示(shi)意圖(tu)

2018年，加州大學伯克利分校Patrick D. Hsu實驗室發現了靶向RNA的Cas13d家族，Cas13d平(ping)均大小為930 aa，是目前發現的哺乳動物細胞中相對較小的Ⅱ類CRISPR效應因子（比其家族成(cheng)員(yuan)Cas13a-c小20%，比Cas9小33%），使(shi)它更容(rong)易包(bao)裝到容(rong)量有限的應用載體(ti)如AAV載體(ti)中(zhong)。此外，Cas13d對RNA靶點的切割不依賴(lai)于(yu)PFS序列(lie)（protospacer flanking sequence，相當于Cas9針對DNA的PAM序列），這極大的增加了Cas13d的應用范圍，使其成為進一步開發靶向RNA工具的潛在平臺。與RNA干(gan)擾技(ji)術相比，Cas13d介導的(de)(de)基因(yin)沉(chen)默具有(you)更高(gao)的(de)(de)特(te)異(yi)性（與數(shu)百個(ge)shRNA脫靶(ba)相比，Cas13d沒有(you)脫靶(ba)）和敲除效(xiao)率（Cas13d達(da)到96％，shRNA達(da)到65％， CRISPRi達(da)到53％）。而與(yu)Cas9介導的基因敲除技術相比(bi)，Cas13d介導的基因沉(chen)默(mo)不會改(gai)變基因組(zu)DNA，因此這(zhe)種基因沉(chen)默(mo)是可逆(ni)的，對一些(xie)后天(tian)性疾(ji)病的治療(liao)更(geng)有優(you)勢（圖5，圖6）。

圖5. 一(yi)種引導和靶向激活Cas13d核糖核酸酶活性的(de)模型(xing)

圖(tu)6. Cas13d系統(tong)具有(you)更高(gao)的特異性和(he)敲除(chu)效率

與此同時，Patrick D. Hsu實驗室又鑒定出一種效果更佳的Cas13d酶：即來(lai)自腸道細菌黃化(hua)瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）XPD3002，被命名為CasRx。隨(sui)后，科學家(jia)通過多項(xiang)實驗(yan)證明了CasRx能在體內外(wai)可(ke)高效敲除RNA。同時(shi)，CasRx蛋白(bai)由(you)于體積(ji)小，編(bian)輯(ji)效率高，被認為(wei)是(shi)在未來中(zhong)極(ji)具應用優勢的Cas13蛋白(bai)。

2020年的(de)(de)一(yi)項(xiang)研(yan)(yan)究探索(suo)了使(shi)用CasRx系(xi)統來定向沉默基(ji)(ji)因的(de)(de)可行性。首先，研(yan)(yan)究者(zhe)選擇(ze)Pten作為(wei)代(dai)謝調控基(ji)(ji)因，研(yan)(yan)究CasRx是(shi)否能以代(dai)謝基(ji)(ji)因為(wei)靶點進(jin)行有效(xiao)的(de)(de)基(ji)(ji)因敲(qiao)除，并制(zhi)備(bei)了多個針(zhen)對Pten mRNA編碼序(xu)列的(de)(de)sgRNAs，研(yan)(yan)究者(zhe)將(jiang)CasRx和每個Pten sgRNA通(tong)(tong)過質(zhi)粒轉(zhuan)(zhuan)導至(zhi)小鼠神經母細胞(bao)瘤N2a細胞(bao)中，并進(jin)行sgRNA的(de)(de)體外(wai)篩選，找到了CasRx敲(qiao)低目的(de)(de)基(ji)(ji)因的(de)(de)最佳sgRNA組合(he)：sgPten-5和sgPten-6。結果顯示，在轉(zhuan)(zhuan)染CasRx、sgPten-5和sgPten-6的(de)(de)N2a細胞(bao)中，Pten的(de)(de)表達水(shui)平顯著降低，AKT的(de)(de)磷酸化水(shui)平顯著升高，此外(wai)與shRNA系(xi)統相比(bi)，CasRx編輯(ji)系(xi)統表現出來更(geng)強的(de)(de)特異性和更(geng)低的(de)(de)脫靶率（圖(tu)7）。（延伸理解：Pten被認為(wei)是(shi)一(yi)種代(dai)謝調節劑，通(tong)(tong)過抑(yi)制(zhi)PI3K/AKT途徑抑(yi)制(zhi)胰島(dao)素信號轉(zhuan)(zhuan)導通(tong)(tong)路，Pten的(de)(de)缺失能促進(jin)AKT的(de)(de)磷酸化）

圖7. CasRx體(ti)外介導Pten的敲除

研(yan)究人員(yuan)通過尾(wei)靜脈注(zhu)射敲(qiao)低(di)(di)Pcsk9的AAV8病毒，顯著(zhu)降低(di)(di)了(le)肝(gan)臟和血清(qing)(qing)中Pcsk9的表達量(liang)以及血清(qing)(qing)中的膽固醇水平。重要的是，CasRx介(jie)導(dao)的Pcsk9敲(qiao)低(di)(di)是可逆的，Pcsk9表達水平可以反復下調。CRISPR/CasRx系統為(wei)可逆調節(jie)代謝基因，尤其是一(yi)些后(hou)天(tian)性疾病（如(ru)因不良生活習慣導(dao)致的高血脂等后(hou)天(tian)代謝性疾病等）提供了(le)一(yi)種(zhong)有(you)效(xiao)的策略（圖(tu)8）。

圖8. CasRx介導的(de)血清膽固醇降低和PCSK9可逆調(diao)節

維真科研團隊針對mcherry基因(yin)設計了多條gRNAs，并選擇了其(qi)中(zhong)兩條敲除(chu)效(xiao)果好的(de)gRNAs（gRNA1和gRNA2），進行了單條gRNA、2in1 gRNAs敲除(chu)效(xiao)果的(de)驗(yan)(yan)證(zheng)試驗(yan)(yan)，結果如下：

從(cong)上述(shu)熒光圖可看出，2in1 gRNAs敲(qiao)除組，mCherry表達水(shui)平大大降低，敲(qiao)除效果(guo)明顯(xian)好于單(dan)條gRNA的敲(qiao)除效果(guo)。

（mcherry表達量(liang)：gRNA1組 0.38；gRNA2組 0.47；gRNA1+2組 0.18）

此外，從上圖mCherry mRNA表達量的檢測實驗結果可以看出，Cas13d(CasRx)-gRNA系統(tong)可以特異高(gao)效地降低(di)靶(ba)向基因的(de)表達（mCherry），并且2in1gRNAs 能實現mRNA水平敲低(di)82%。

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