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研究領域

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《Science》北大李毓龍課題組與中科院腦智卓越中心徐敏課題組合作揭示：基底前腦谷氨酸能神經元調控睡眠穩態因子腺苷

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背景介紹

睡眠是(shi)生(sheng)命所(suo)需(xu)。人一(yi)生(sheng)中有將近1/3的時間(jian)處于(yu)睡眠狀(zhuang)態。睡眠質量(liang)的好壞與人體(ti)健(jian)康密切相關。睡眠障礙會(hui)引(yin)起負(fu)面情緒，嚴(yan)重時會(hui)引(yin)發重大精神疾病。但是(shi)人為什(shen)么需(xu)要(yao)睡眠？熬(ao)夜后為什(shen)么睡得更沉、更香？睡眠到底(di)是(shi)如何被調控的呢？一(yi)系(xi)列科學問題(ti)尚待(dai)解決。

人體內有兩大系統會引發睡意：睡眠穩態與晝夜節律。晝夜節律是通過內在的生物鐘控制一天中睡眠覺醒的時間；睡眠穩態則主要(yao)是(shi)由睡(shui)眠(mian)壓力進(jin)行調(diao)(diao)控(kong)(kong)，睡(shui)眠(mian)壓力的累(lei)計程度控(kong)(kong)制機體(ti)的睡(shui)眠(mian)量。先前(qian)(qian)研究已鑒定(ding)了許(xu)多睡(shui)眠(mian)穩態(tai)因(yin)子(zi)和生物學(xue)過(guo)程。其中，基底前(qian)(qian)腦（basal forebrain，BF）腺苷的釋(shi)放是(shi)睡(shui)眠(mian)穩態(tai)的重(zhong)要(yao)生理調(diao)(diao)節因(yin)子(zi)。腦內與睡(shui)眠(mian)覺醒(xing)相關的神經(jing)(jing)核團(tuan)有很多，BF是(shi)調(diao)(diao)控(kong)(kong)該周期的一個(ge)重(zhong)要(yao)核團(tuan)。BF內含有膽堿能、谷氨酸(suan)能和GABA能多種類(lei)型神經(jing)(jing)元(yuan)，這些神經(jing)(jing)元(yuan)活動如何調(diao)(diao)控(kong)(kong)腺苷的釋(shi)放仍是(shi)一個(ge)謎。

近日，北大李毓龍課題組與中科院腦智卓越創新中心徐敏課題組合作在《Science》發表了題為《Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons》的研究論文。該項研究利用新型遺傳編碼的高靈敏性、高特異性和高時間分辨率的腺苷探針，聯合運用光纖記錄、光遺傳學和細胞特異損毀技(ji)術揭(jie)示了(le)BF谷氨(an)酸能神(shen)經元在調控(kong)腺苷(gan)動態變(bian)化和睡(shui)眠穩態中的(de)關鍵作用，進一步闡明了(le)睡(shui)眠穩態調控(kong)的(de)神(shen)經環路機(ji)制，為探索睡(shui)眠障礙的(de)治療方法提(ti)供了(le)重(zhong)要參(can)考。

部分研究結果

01 新型遺傳編碼腺苷探針的開發和特征描述

為了(le)高特異(yi)(yi)性和(he)高時(shi)間分(fen)辨率(lv)檢測睡眠(mian)覺醒周期中BF胞(bao)外腺苷(gan)濃度的(de)(de)(de)動態變(bian)化，李毓龍教授組開發了(le)腺苷(gan)探針(zhen)（GRABAdo），該探針(zhen)的(de)(de)(de)檢測原(yuan)理(li)是基(ji)于腺苷(gan)G蛋(dan)白偶聯受體(ti)的(de)(de)(de)激活，使胞(bao)外腺苷(gan)的(de)(de)(de)濃度通過綠(lv)色(se)熒(ying)光蛋(dan)白的(de)(de)(de)熒(ying)光強度來測量(liang)。作者(zhe)從靈敏性、特異(yi)(yi)性和(he)胞(bao)內信(xin)(xin)號通路的(de)(de)(de)偶聯等方面分(fen)別進(jin)行了(le)實(shi)驗(yan)，發現迭(die)代優化后的(de)(de)(de)GRABAdo1.0（簡(jian)稱Ado1.0）具有較高的(de)(de)(de)靈敏性和(he)特異(yi)(yi)性，同(tong)時(shi)與胞(bao)內信(xin)(xin)號通路具有微(wei)乎其微(wei)的(de)(de)(de)偶聯，對細胞(bao)生理(li)無明(ming)顯影響（圖(tu)1）。

圖1. 基因編碼腺苷探針的設計與特征

02 睡眠覺醒周期中胞外腺苷的動態變化

據睡(shui)(shui)眠中(zhong)腦(nao)電圖(tu)表現、眼球(qiu)(qiu)運動(dong)情況和(he)(he)肌張力變(bian)化(hua)(hua)，睡(shui)(shui)眠可(ke)分(fen)為(wei)非快(kuai)速(su)(su)眼球(qiu)(qiu)運動(dong)睡(shui)(shui)眠 (NREMS)和(he)(he)快(kuai)速(su)(su)眼球(qiu)(qiu)運動(dong)睡(shui)(shui)眠(REMS)兩種時(shi)(shi)(shi)(shi)相(xiang)。其中(zhong)，REMS由于(yu)持續時(shi)(shi)(shi)(shi)間短(duan)，傳統(tong)的(de)(de)(de)(de)微透析無(wu)法記錄(lu)腺苷(gan)(gan)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)。腺苷(gan)(gan)探針的(de)(de)(de)(de)高時(shi)(shi)(shi)(shi)間分(fen)辨(bian)率使(shi)問題得(de)到了(le)有效解決。作者使(shi)用AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0-mScarlet和(he)(he)AAV2/9-hsyn-GRABAdo-mut腦(nao)立體(ti)定位注射小鼠(shu)BF并測量熒光信(xin)號。為(wei)了(le)排除運動(dong)噪音，作者將Ado1.0與紅色(se)熒光蛋(dan)白(bai)(bai)mScarlet融(rong)合(he)表達，該紅色(se)熒光蛋(dan)白(bai)(bai)對(dui)腺苷(gan)(gan)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)不敏感。實驗結(jie)果(guo)顯示(shi)：小鼠(shu)BF胞外腺苷(gan)(gan)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)順序為(wei)：快(kuai)速(su)(su)眼動(dong)睡(shui)(shui)眠階(jie)(jie)段>覺(jue)醒(xing)階(jie)(jie)段>非快(kuai)速(su)(su)眼動(dong)睡(shui)(shui)眠階(jie)(jie)段(后2個階(jie)(jie)段的(de)(de)(de)(de)結(jie)果(guo)跟傳統(tong)微透析的(de)(de)(de)(de)結(jie)果(guo)一致)。而且(qie)，當小鼠(shu)在這三種狀(zhuang)態間轉換(huan)時(shi)(shi)(shi)(shi)，腺苷(gan)(gan)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)(hua)相(xiang)對(dui)較(jiao)快(kuai)。胞外腺苷(gan)(gan)濃度(du)的(de)(de)(de)(de)快(kuai)速(su)(su)變(bian)化(hua)(hua)揭示(shi)其釋放可(ke)能依賴于(yu)神經活動(dong)（圖(tu)2）。

圖2. 小鼠基底前腦在睡眠覺醒周期中的腺苷動力學檢測

03 睡眠覺醒周期小鼠基底前腦膽堿能神經元對腺苷濃度變化的調節

先前(qian)已有研究(jiu)表明，BF膽堿能神(shen)經(jing)元(yuan)（ChAT+）和(he)谷氨酸能神(shen)經(jing)元(yuan)（VGLUT2+）在覺醒(xing)和(he)REMS階段非常(chang)活(huo)躍，而且利用(yong)光(guang)遺傳學技術激活(huo)這兩類神(shen)經(jing)元(yuan)可以促進機體覺醒(xing)。因此，作(zuo)者首先通(tong)過檢測(ce)ChAT+神(shen)經(jing)元(yuan)活(huo)動與胞(bao)外腺苷(gan)濃(nong)度(du)變(bian)化(hua)的相關性(xing)研究(jiu)了BF ChAT+神(shen)經(jing)元(yuan)的作(zuo)用(yong)。作(zuo)者利用(yong)“兩側雙(shuang)探針”法將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和(he)AAV2/9-EF1α-DIO-GCaMP6s分別注(zhu)入ChAT-Cre小(xiao)鼠(shu)大腦(nao)半球兩側BF，2周后測(ce)定熒光(guang)信(xin)號(hao)，實驗數據表明，ChAT+神(shen)經(jing)元(yuan)鈣(gai)活(huo)動與胞(bao)外腺苷(gan)濃(nong)度(du)的變(bian)化(hua)高度(du)相關，且鈣(gai)活(huo)動通(tong)常(chang)早于(yu)腺苷(gan)信(xin)號(hao)變(bian)化(hua)~24 s，表明BF ChAT+神(shen)經(jing)元(yuan)可能調控(kong)胞(bao)外腺苷(gan)的濃(nong)度(du)變(bian)化(hua)。

接著，作(zuo)者將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和AAV2/9-hSyn-FLEX-ChrimsonR-tdTomato 混合注射ChAT-Cre小鼠BF，光遺傳激活(huo)ChAT+神經(jing)元(yuan)，利(li)用光纖記錄(lu)腺苷(gan)(gan)的(de)(de)(de)釋(shi)放(fang)量。ChAT+神經(jing)元(yuan)的(de)(de)(de)激活(huo)引起胞(bao)(bao)外腺苷(gan)(gan)小幅顯著增加(jia)，表明(ming)ChAT+神經(jing)元(yuan)可(ke)調節睡眠覺醒周期中胞(bao)(bao)外腺苷(gan)(gan)濃(nong)度(du)(du)的(de)(de)(de)變化(hua)。但是，誘發(fa)腺苷(gan)(gan)濃(nong)度(du)(du)變化(hua)的(de)(de)(de)幅度(du)(du)在不同試驗中有較(jiao)大差異，表明(ming)BF中可(ke)能存(cun)在其它類型神經(jing)細胞(bao)(bao)調節睡眠覺醒周期中胞(bao)(bao)外腺苷(gan)(gan)濃(nong)度(du)(du)的(de)(de)(de)變化(hua)（圖3）。

圖3. BF膽堿能神經元中的鈣活動與胞外腺苷濃度變化相關

04 睡眠覺醒周期小鼠基底前腦谷氨酸能神經元對腺苷濃度變化的調節

隨后(hou)，作者采用同樣(yang)的(de)(de)(de)“兩側(ce)雙(shuang)探針”法又進一步(bu)研究了BF VGLUT2+神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)的(de)(de)(de)調(diao)節作用。實驗數據表明，BF VGLUT2+神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)中的(de)(de)(de)鈣活(huo)動與胞外(wai)腺(xian)苷(gan)(gan)濃(nong)度變化高度相(xiang)關，且早于(yu)腺(xian)苷(gan)(gan)信(xin)號(hao)~41s。光遺傳(chuan)激活(huo)VGLUT2+神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)可引起(qi)胞外(wai)腺(xian)苷(gan)(gan)濃(nong)度大幅增加，并(bing)且高于(yu)激活(huo)ChAT+神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)所引起(qi)的(de)(de)(de)胞外(wai)腺(xian)苷(gan)(gan)濃(nong)度，這表明VGLUT2+神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)對調(diao)節睡眠(mian)覺(jue)醒周期中胞外(wai)腺(xian)苷(gan)(gan)濃(nong)度的(de)(de)(de)變化貢獻(xian)更(geng)大。

接下(xia)來，作(zuo)者用Caspase-3特異損毀BF VGLUT2+神經元，測量(liang)腺苷濃度的(de)變化。將AAV2/9-hsyn-GRABAdo1.0和(he)AAVDJ-flex-taCasp3-TEVp混合注射VGLUT2-Cre小鼠BF，兩周(zhou)后(hou)觀察到BF VGLUT2+神經元數量(liang)顯著減(jian)少。與對(dui)照組相比，實驗組小鼠BF胞外腺苷濃度的(de)增加(jia)(jia)在(zai)覺醒和(he)REM階段(duan)顯著減(jian)少。上述結果進一步(bu)證明BF VGLUT2+神經元對(dui)胞外腺苷濃度增加(jia)(jia)起重要調節(jie)作(zuo)用（圖4）。

圖4. 睡眠覺醒周期中，BF VGLUT2+神經元有助于胞外腺苷濃度的增加

05 BF谷氨酸能神經元的損毀會破壞睡眠穩態

最后(hou)，作(zuo)者通過(guo)細胞(bao)特異(yi)性損毀驗證(zheng)了(le)BF中VGLUT2+神(shen)(shen)經元的缺(que)失會(hui)影響小鼠(shu)睡眠(mian)穩態。與(yu)對照(zhao)組相比，BF VGLUT2+神(shen)(shen)經元缺(que)失的小鼠(shu)在覺醒狀態下的時間明(ming)顯更長，且(qie)這(zhe)種差異(yi)主要表現(xian)為小鼠(shu)在夜晚清醒度增加。

作者(zhe)又檢(jian)測了BF VGLUT2+神經元的(de)缺(que)失(shi)是否(fou)會影(ying)響(xiang)睡(shui)眠(mian)(mian)(mian)(mian)恢復。亮燈6h使老鼠(shu)保持清(qing)醒狀態，隨后(hou)18h內進(jin)行恢復性睡(shui)眠(mian)(mian)(mian)(mian)。實驗組小(xiao)鼠(shu)NREM睡(shui)眠(mian)(mian)(mian)(mian)明(ming)顯(xian)減少(shao)，并且NREM睡(shui)眠(mian)(mian)(mian)(mian)時(shi)間下降速(su)度明(ming)顯(xian)加快。上述結果表(biao)明(ming)BF VGLUT2+神經元的(de)缺(que)失(shi)影(ying)響(xiang)了小(xiao)鼠(shu)的(de)睡(shui)眠(mian)(mian)(mian)(mian)穩(wen)態（圖(tu)5）。

圖5. BF谷氨酸能神經元的損毀會破壞睡眠穩態

小結

此研究中，作者開發了一種新型的高靈敏度、高特異性和高時間分辨率的腺苷探針（GRAB_Ado），通過(guo)結(jie)合光遺(yi)傳學操作和細胞特異(yi)損毀技術，闡明了睡眠(mian)覺醒(xing)周(zhou)期中(zhong)小(xiao)鼠基底前腦谷氨酸能神經(jing)元調(diao)節胞外(wai)腺苷濃度變化，積累睡眠(mian)壓力(li)，從而對睡眠(mian)穩態(tai)具有重要調(diao)節作用。該研究為機體在(zai)清醒(xing)狀態(tai)下神經(jing)活動通過(guo)刺(ci)激促(cu)眠(mian)因子的釋放而增(zeng)加睡眠(mian)壓力(li)的機制提供了新的見(jian)解。

原文鏈接：

維真生物助力病毒及用法

AAV病毒	AAV2/9-hsyn-GRAB_Ado1.0-mScarlet; AAV2/9-hsyn-GRAB_Ado1.0 ; AAV2/9-hsyn-GRAB_Ado-mut;
注射動物	7周齡以上雄性和雌性小鼠
注射體積	0.2 ~ 0.4 μl
注射方式	腦立體定位注射
注射位置	基底前腦
檢測時間	2周

李毓龍教授組其他神經遞質探針（部分）

探針類別	病毒名稱
膽堿類	乙酰膽堿探針
	AAV9-hSyn-GACh2.0
	AAV9-TRE-GACh2.0
	AAV9-hSyn-ACh3.0(ACh4.3)
	AAV9-CaMKII-ACh3.0(ACh4.3)
	AAV9-GfaABC1D-ACh3.0(ACh4.3)
	……
嘌呤類	腺苷探針
	AAV9-hsyn-Ado1.0(B10)
	AAV DJ-hsyn-Ado1.0(B10)
	AAV9-EFS-DIO-Ado1.0
	AAV9-GfaABC1D-Ado1.0
	AAV9-hsyn-Ado1.0mut(B10-F168A)
	……
	腺苷三磷酸探針
	AAV9-hsyn-ATP1.0(B09)
	AAV DJ-hsyn-ATP1.0
	AAV9-EFS-DIO-ATP1.0
	AAV9-GfaABC1D-ATP1.0
	AAV9-hsyn-ATP1.0mut(B09 N283A)
	……
生物胺類	多巴胺探針
	AAV9-hSyn-DA1h(DA4.2)
	AAV9-hSyn-DIO-DA1h(DA4.2)
	AAV9-hSyn-DA1hmut(DA4.2mut)
	AAV9-TRE-DA1hmut(DA4.2mut)
	AAV9-CaMKII-DA1h(DA4.2)
	……
	五羥色胺探針
	AAV9-hsyn-r5HT1.0
	AAV9-CAG-r5HT1.0
	AAV9-hsyn-r5HT2.0
	AAV9-hsyn-5HT2.1(renamed as 5-HT1.0)
	AAV9-hsyn-DIO-5HT2.1(renamed as 5-HT1.0)
	……
	組胺探針
	AAV9-hsyn-HA1.0h (His1.0)
	AAV9-hsyn-HA1.0mut (His1.0mut)
	AAV9-hsyn-HA1.0m (His1.0M)
	AAV9-hsyn-DIO-HA1.0h
	AAV9-hsyn-HA1.0h-mScarlet
	……
	去甲腎上腺素探針
	AAV9-hsyn-NE1m(NE2.1)
	AAV9-hSyn-DIO-NE1m(NE2.1)
	AAV9-hSyn-NEmut(NE2.1mut)
	AAV9-TRE-NE1m(NE2.1)
	AAV9-hsyn-mRuby3-NE1m(NE2.1)
	……
神經肽類	血管活性腸肽探針
	AAV9-hsyn-VIP1.0
	AAV9-hsyn-DIO-VIP1.0
	……
	神經肽Y探針
	AAV9-hsyn-NPY1.0
	AAV9-EF1a-DIO-NPY1.0
	……
	神經降壓肽探針
	AAV9-hsyn-NTS1.0
	……
	膽囊收縮素
	AAV9-hsyn-CCK2.0
	AAV1-hsyn-CCK2.0
	AAV9-hsyn-DIO-CCK2.0
	……
	促腎上腺皮質激素釋放激素探針
	AAV9-hSyn-CRF3.0
	AAV9-EFS-DIO-CRF3.0
	AAV9-CaMKII-CRF3.0
	AAV9-hSyn-CRFmut
	AAV9-EFS-DIO-CRFmut
	……
	精氨酸血管加壓素探針
	AAV9-hsyn-AVP2.0
	AAV9-hsyn-DIO-AVP2.0
	……
	催產素探針
	AAV9-hSyn-OXT1.0
	AAV9-EFS-DIO-OXT1.0
	AAV9-hSyn-OXTmut
	AAV9-EFS-DIO-OXTmut
	……
	生長激素抑制素探針
	AAV9-hsyn-SST2.0
	AAV9-hsyn-DIO-SST2.0
	……
其他	大麻素AEA探針
	AAV9-hsyn-AEA1.0
	……
	內源性大麻素eCB探針
	AAV9-hsyn-eCB2.0
	AAV9-hsyn-DIO-eCB2.0
	AAV9-hsyn-eCB2.0mut
	AAV9-hsyn-DIO-eCB2.0mut
	AAV9-GfaABC1D-eCB2.0
	……
	褪黑素探針
	AAV9-hsyn-MT2.0
	……
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