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《Cell》‖ 浙江大學靳津和東南大學柴人杰研究團隊聯合發文:應激反應致外周CD4+ T細胞代謝紊亂誘發焦慮行為

應激反應是各種緊張性刺激物引起的個體非特異性反應，包括生理反應和心理反應兩大類。生理反應表現為交感神經興奮、垂體和腎上腺皮質激素分泌增多、血糖升高、血壓上升、心率加快等；心理反應包括情緒反應與自我防御反應等。研究發現應激反應會引起外周T淋巴細胞功能紊亂，腦神經可塑性的變化，增加抑郁和焦慮的風險。T淋巴細胞在情感障礙疾患中的調節機制和病理性作用是怎樣的呢？浙江大學靳津和東南大學柴人杰研究團隊使用維真生物AAV-shRNA產品在《Cell》（IF=38.637）雜志聯合發表“Stress-Induced Metabolic Disorder in Peripheral CD4+T Cells Leads to Anxiety-like Behavior”的研究論文，文章揭示了CD4+ T細胞嘌呤代謝紊亂與應激誘導的焦慮行為之間的關聯。

研究結果

1. CD4+ T細胞在應激誘導的焦慮行為中起重要的作用

作(zuo)者通過足部電擊 (electronic foot shock，ES)野生型(xing)（WT）和Rag1-/- （免疫(yi)缺(que)陷）小(xiao)鼠(shu)誘發(fa)焦慮模型(xing)，開場試驗（Open Field Test，OFT）發(fa)現，Rag1-/-小(xiao)鼠(shu)對(dui)中心(xin)區域(yu)探索和運動的(de)興趣沒有(you)降低，與研究報道急性ES小(xiao)鼠(shu)的(de)外(wai)周血管CD4+和CD8+淋巴(ba)細胞數(shu)量(liang)明顯增加結果一致，表明焦慮發(fa)生的(de)起始階段免疫(yi)系統會(hui)適應性的(de)改變。

通過(guo)靜脈注射(she)中和(he)抗體來耗盡CD4+和(he)CD8+細胞，作(zuo)者發(fa)現只(zhi)有(you)CD4+ T細胞的去除顯(xian)著逆(ni)轉了OFT和(he)高架十字迷(mi)宮(gong)實驗（elevated plus-maze test，EPM）ES誘(you)導的焦慮(lv)(lv)行為。CD4+ T細胞缺乏可以阻止急性束縛應激（acute restraint stress，RS）引(yin)起小鼠產(chan)生焦慮(lv)(lv)。上述結果(guo)表(biao)明CD4+ T細胞對物理(li)應激誘(you)發(fa)的焦慮(lv)(lv)行為有(you)著廣泛的影響(xiang)。

為(wei)評價(jia)T細(xi)(xi)胞(bao)是否具有焦慮(lv)印跡保留作用，將(jiang)NT小(xiao)鼠和ES小(xiao)鼠脾臟(zang)CD4+或CD8+ T細(xi)(xi)胞(bao)分別過繼轉移到Rag1-/- 小(xiao)鼠，發(fa)現(xian)只(zhi)有接受ES誘(you)導的CD4+T細(xi)(xi)胞(bao)的Rag1-/-小(xiao)鼠在OFT中產(chan)生焦慮(lv)行為(wei)，且初(chu)始CD4+ T細(xi)(xi)胞(bao)引發(fa)的焦慮(lv)程度要比效(xiao)應(ying)T細(xi)(xi)胞(bao)更嚴重。（實驗結果如圖1）

圖1  CD4+ T細胞在應激誘導的焦慮行為中起重要作用

2. 應激誘導外周血CD4+T細胞線粒體分裂

測(ce)序分析(xi)ES小鼠的CD4+和(he)(he)CD8+ T細(xi)胞RNA轉錄組，CD4+ T細(xi)胞中鑒定出128個特異(yi)(yi)性差異(yi)(yi)表(biao)達基因(yin)(yin)(DEGs)，基因(yin)(yin)本體分析(xi)顯示大多數DEGs編碼線(xian)粒體蛋(dan)白質。胞外酸(suan)化(hua)(hua)速率(lv)（extracellular acidification rate, ECAR）和(he)(he)耗氧(yang)速率(lv)（axygen consumption rate, OCR）測(ce)定顯示，ES和(he)(he)RS小鼠初始CD4+ T細(xi)胞的糖酵(jiao)解和(he)(he)氧(yang)化(hua)(hua)磷酸(suan)化(hua)(hua)水平均顯著下降，線(xian)粒體的結構和(he)(he)功能受到(dao)影響。通過共聚(ju)焦顯微成像(xiang)和(he)(he)免疫印跡技術檢測(ce)，發現(xian)ES初始CD4+ T細(xi)胞的線(xian)粒體呈點狀(zhuang)(zhuang)，線(xian)粒體融合的外膜蛋(dan)白MFN2和(he)(he)MIGA2顯著減少，表(biao)明CD4+ T細(xi)胞在應(ying)激狀(zhuang)(zhuang)態(tai)下表(biao)現(xian)為線(xian)粒體形態(tai)異(yi)(yi)常和(he)(he)代(dai)謝功能障礙(ai)。

研究發(fa)現白三烯B4（LTB4）給藥會使(shi)小鼠產生嚴重的(de)焦慮行為(wei)，去(qu)除CD4+ T細胞(bao)后焦慮行為(wei)消失(shi)。體外實驗顯(xian)示(shi)在應(ying)(ying)激(ji)反應(ying)(ying)中LTB4顯(xian)著增加(jia)線粒體分裂，降低了MFN2和MIGA2在初始CD4 + T細胞(bao)中的(de)表達。研究證(zheng)明(ming)應(ying)(ying)激(ji)反應(ying)(ying)可(ke)誘導LTB4啟動(dong)外周血CD4+ T細胞(bao)線粒體的(de)裂變，并(bing)引發(fa)焦慮。（實驗結果(guo)如圖2）

圖2  應激導致CD4+ T細胞代謝紊亂和線粒體裂變

為了確定T細胞線粒體形態與焦慮行為的關系，作者建立了Miga2-/-小鼠，OFT、EPM、暗-光轉換和懸尾實驗中，Miga2-/-小鼠表現出嚴重的抑郁癥狀，并在初始CD4+ T中觀察到了高度破碎的線粒體。為了進一步闡明外周血CD4+ T細胞線粒體分裂的特殊功能，作者生成了Miga2 T細胞條件敲除(KO) (Miga2TKO)小鼠。缺乏Miga2的T細胞在T淋巴細胞的發育和穩態方面沒有表現出任何明顯的異常，但Miga2TKO小鼠仍然表現出類似于Miga2-/-小鼠的焦慮樣行為。Miga2TKO小鼠在連續EPM測試中表現出正常的恐懼記憶消失，說明Miga2缺陷的CD4+ T細胞對正常的學習記憶沒有影響。為了消除Miga蛋白在焦慮中的特殊功能，作者又生成了Mfn1和Mfn2 T細胞條件下雙KO (Mfn1/ 2TKO)小鼠(shu)，T細胞(bao)中缺乏Mfn1/2的(de)(de)小鼠(shu)與野生型小鼠(shu)相(xiang)比也(ye)表現(xian)出(chu)類(lei)似焦(jiao)慮的(de)(de)行為，這表明(ming)焦(jiao)慮行為是由(you)線粒體(ti)形態紊亂引起的(de)(de)，而不是由(you)某些(xie)線粒體(ti)蛋白的(de)(de)特定功能引起的(de)(de)。（實驗結果如圖3）

圖3  CD4+ T細胞線粒體的持續分裂導致產生焦慮行為

3. T細胞線粒體的持續裂變導致全身嘌呤代謝紊亂

聚類分析顯示(shi)Miga2TKO小(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)(de)代(dai)謝(xie)組學(xue)特征與(yu)同窩WT小(xiao)(xiao)鼠有顯著(zhu)差異，代(dai)謝(xie)產物的(de)(de)(de)差異主要集中于嘌(piao)(piao)(piao)呤(ling)(ling)代(dai)謝(xie)。Miga2TKO小(xiao)(xiao)鼠體內嘌(piao)(piao)(piao)呤(ling)(ling)及其衍生(sheng)(sheng)物（腺嘌(piao)(piao)(piao)呤(ling)(ling)、次(ci)黃嘌(piao)(piao)(piao)呤(ling)(ling)和(he)黃嘌(piao)(piao)(piao)呤(ling)(ling)）的(de)(de)(de)含量是(shi)同窩野生(sheng)(sheng)型小(xiao)(xiao)鼠的(de)(de)(de)10-100倍。去除CD4+ T細胞后，Miga2TKO小(xiao)(xiao)鼠血(xue)清黃嘌(piao)(piao)(piao)呤(ling)(ling)濃度顯著(zhu)降低。在兩(liang)種嚙(nie)齒動(dong)物焦慮模型和(he)過繼(ji)性轉移ES小(xiao)(xiao)鼠CD4+ T細胞的(de)(de)(de)Rag1-/-小(xiao)(xiao)鼠血(xue)清中也(ye)觀察到黃嘌(piao)(piao)(piao)呤(ling)(ling)濃度明細增加。

WT小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)體內注射合成的(de)黃嘌(piao)(piao)呤或腺苷發(fa)現，黃嘌(piao)(piao)呤、腺嘌(piao)(piao)呤和單磷(lin)酸阿糖(tang)腺苷都能引(yin)發(fa)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)產生(sheng)焦(jiao)(jiao)慮(lv)行為。BCX-1777（嘌(piao)(piao)呤核苷磷(lin)酸化酶抑制劑(ji)）明顯(xian)降低(di)Miga2TKO和ES小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)的(de)焦(jiao)(jiao)慮(lv)癥狀(zhuang)，同(tong)時(shi)顯(xian)著降低(di)小(xiao)(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)血清(qing)黃嘌(piao)(piao)呤的(de)濃度(du)。由(you)此可知，病理性(xing)CD4+ T細(xi)胞引(yin)起的(de)黃嘌(piao)(piao)呤過量(liang)在焦(jiao)(jiao)慮(lv)行為中(zhong)起至關重要的(de)作(zuo)用。（實驗(yan)結果如圖4）

圖4  CD4+ T細胞線粒體的分裂導致血清嘌呤增加

4. 黃嘌呤直接作用于小鼠左側杏仁核的少突膠質細胞

研究表明杏仁核在恐懼和持續焦慮的產生起關鍵作用，左杏仁核與社交焦慮、強迫癥、創傷后應激以及焦慮有關。組織學分析發現，Miga2TKO小鼠左杏仁核比右杏仁核和WT小鼠杏仁核更大，非神經元細胞的數量更多。經黃嘌呤處理的小鼠左杏仁核表現出與Miga2TKO小鼠相似的病理表型(xing)。單細胞(bao)RNA測序顯示，腺嘌呤和黃嘌呤發揮(hui)通過A1、A2A、A2B和A3四(si)種(zhong)受體亞型(xing)發揮(hui)各自(zi)的生理功能，且A1在(zai)少突膠(jiao)質細胞(bao)中大量(liang)表達(da)。

作者分析了 WT、Miga2-/-、αCD4處理的Miga2-/-小鼠杏仁核中非神經元細胞的轉錄組。scRNA 序列和FACS分析顯示Miga2-/-小鼠少突膠質細胞比例顯著增加，去除CD4+ T細胞可逆轉此現象。BRdU摻入試驗發現，黃嘌呤作為致病因素，可顯著增加少突膠質細胞的DNA合成和細胞周期，直接誘發少突膠質細胞的增殖。已有資料表明黃嘌呤作用于A1受體并促進蛋白激酶A (PKA)/ cAMP的活性。作者發現Miga2-/-小鼠少突膠質細胞中PKA/ cAMP通路被明顯激活，耗盡CD4+T細胞可下調該通路。作為左側杏仁核少突膠質細胞唯一可檢測到的腺苷受體A1，通過注射腺相關病毒AAV-MBP-shAdor1-GFP（維真生物提供）成功地特異性敲低A1受體，Miga2-/-小鼠不再表現出焦(jiao)慮癥狀。（實(shi)驗(yan)結(jie)果如(ru)圖5）

圖5  CD4+ T細胞來源的黃嘌呤通過A1受體作用于左杏仁核的少突膠質細胞

5. 線粒體裂變促進CD4+ T細胞中黃嘌呤的合成

嘌呤有兩種合成途徑：從頭合成和回收。在從頭合成途徑中，葡萄糖代謝產物5-磷酸糖苷基-1-焦磷酸(PRPP)提供了形成嘌呤環的骨架結構。研究發現Miga2-/-和Mfn1/2TKO小鼠(shu)CD4+ T細胞氧化(hua)磷(lin)酸(suan)(suan)化(hua)和(he)糖(tang)(tang)酵解活性(xing)顯(xian)著降低，但5-磷(lin)酸(suan)(suan)核糖(tang)(tang)（R-5-P）、CAIR、腺苷和(he)肌苷則大(da)量增(zeng)加，表明線粒(li)體(ti)在(zai)從融合(he)到裂變過(guo)程中，葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)通過(guo)磷(lin)酸(suan)(suan)戊糖(tang)(tang)途徑（PPP）重(zhong)新合(he)成(cheng)嘌(piao)呤(ling)。2-脫氧-D-葡(pu)萄(tao)糖(tang)(tang)（抑(yi)制糖(tang)(tang)酵解、PPP和(he)嘌(piao)呤(ling)的合(he)成(cheng)）可使Miga2TKO小鼠(shu)的焦慮癥狀和(he)左杏仁(ren)核病理特征恢復正(zheng)常。

WT和Miga2-/-小鼠初始CD4+ T細胞的轉錄組分析表明，Miga2-/-小鼠的 CD4 + T細胞與糖酵解和脂肪酸?氧化途徑相關的多個關鍵酶轉錄水平顯著降低，但是嘌呤合成所需的分子：己糖激酶3 (Hk3)、腺苷脫氨酶(Ada)、嘌呤核苷磷酸化酶2 (Pnp2)和黃嘌呤氧化酶/黃嘌呤脫氫酶(Xdh)有所增加。PNP催化肌苷和鳥苷轉化為次黃嘌呤或鳥嘌呤。與PNP相似，PNP2也是一種調節嘌呤代謝途徑和黃嘌呤產生的酶，由于其在初始CD4+ T細胞中的低表達，認為其缺乏可能不會像PNP缺乏那樣導致嚴重的免疫缺陷。Pnp2-/-小鼠未表現出任何明顯的T淋巴細胞發育或成熟障礙，進一步與Miga2-/-小鼠雜交產生Pnp2-/-/Miga2-/-小鼠，當Pnp2-/-/Miga2-/-CD4+ T細胞過繼轉入Rag1-/-小鼠后，Pnp2-/-/Miga2-/- CD4+ T細胞不像Miga2-/- CD4+ T細胞那樣引起焦慮癥狀。由于Pnp2缺失不能完全阻斷黃嘌呤的合成，在移植Pnp2-/-/Miga2-/- CD4+ T細胞的Rag1-/- 小鼠血(xue)清中，黃(huang)嘌呤仍(reng)有(you)適度(du)升高(gao)。這(zhe)些結果表(biao)明CD4+ T細(xi)胞來(lai)源的過量黃(huang)嘌呤可直接(jie)導致焦慮行為(wei)。（實驗結果如圖6）

圖6  CD4+ T細胞線粒體的裂變促進嘌呤從頭合成途徑

干擾素調節因(yin)子(zi)(zi)-1（IRF-1）作(zuo)(zuo)(zuo)為一種(zhong)轉錄(lu)因(yin)子(zi)(zi)，參與細(xi)胞(bao)增殖、分化、凋亡和(he)(he)免疫調節等(deng)多種(zhong)細(xi)胞(bao)過程。作(zuo)(zuo)(zuo)者(zhe)發現Miga2-/-和(he)(he)ES小(xiao)鼠CD4+T細(xi)胞(bao)中(zhong)IRF-1顯著(zhu)積累。染色質免疫共沉淀技術研究表(biao)明巨噬細(xi)胞(bao)IRF-1富集于Ada、Xdh和(he)(he)Pnp2的啟(qi)動子(zi)(zi)區域。IRF-1缺(que)乏使Miga2-/-小(xiao)鼠CD4+ T細(xi)胞(bao)Ada和(he)(he)Xdh mRNA和(he)(he)蛋白(bai)水平恢復正常化，減輕了Miga2TKO小(xiao)鼠的焦慮(lv)行為。CD4+ T細(xi)胞(bao)中(zhong)的IRF-1在線粒體裂變(bian)調節嘌呤合成并產生焦慮(lv)癥(zheng)狀中(zhong)起著(zhu)至(zhi)關重要的作(zuo)(zuo)(zuo)用。（實驗結果如圖7）

圖7  IRF-1的積累促進嘌呤合成和焦慮行為

結論

本(ben)研究(jiu)揭示了外周血CD4+ T細胞來(lai)源的黃(huang)嘌呤和焦慮行(xing)為之(zhi)間的重要聯系。如下：

小V相(xiang)信AAV-shRNA相(xiang)關產品將對各(ge)種精神和代謝疾病藥物的研(yan)發提供(gong)巨大(da)幫(bang)助。