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稀疏標記技術—實現對單個神經元的重構

顧名思義(yi)，單細胞(bao)標(biao)記(ji)/稀疏標(biao)記(ji)技術就是對(dui)單個神(shen)經元進行(xing)明(ming)亮標(biao)記(ji)，從而實(shi)現在單神(shen)經元水(shui)平上解析(xi)大腦結構(gou)，繪制單神(shen)經元投(tou)射圖譜(pu)。

2. 為(wei)什么要對單個神經元(yuan)進(jin)行標記？

以往的研(yan)究主要注重于(yu)描繪大腦(nao)(nao)中的不同腦(nao)(nao)區之間(jian)以及不同位置神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)類群之間(jian)的連(lian)(lian)接，雖然這(zhe)些腦(nao)(nao)連(lian)(lian)接圖譜(pu)揭示了神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)系統的基本(ben)結(jie)構，但由于(yu)缺乏單細胞精(jing)度，腦(nao)(nao)區水平或神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)類群水平的連(lian)(lian)接圖譜(pu)并不能準(zhun)確(que)(que)反映神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)系統的精(jing)細結(jie)構，因此闡明單個神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)的軸突(tu)和樹突(tu)投射模式已經(jing)成為探(tan)索大腦(nao)(nao)神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)回(hui)路(lu)結(jie)構的關鍵，重建單個神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)不僅(jin)能幫助我們了解(jie)其(qi)在神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)環路(lu)中的形態結(jie)構，還有(you)助于(yu)精(jing)確(que)(que)解(jie)析有(you)關神(shen)(shen)(shen)(shen)經(jing)信號如何組織及如何通過大腦(nao)(nao)傳遞到(dao)目(mu)標區域。

雙(shuang)AAV載體(ti)稀疏標(biao)記(ji)系統(tong)是由北京生命科(ke)學研究所羅敏(min)敏(min)教授團隊(dui)和華中(zhong)科(ke)技(ji)大(da)學龔輝教授團隊(dui)合力開發的(de)(de)(de)，這一基于腺相關病毒（AAV）載體(ti)的(de)(de)(de)標(biao)記(ji)方(fang)法能(neng)夠以(yi)細胞類(lei)型和投(tou)射特異(yi)性對單個(ge)神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)進行強烈和稀疏標(biao)記(ji)。利用此系統(tong)，研究團隊(dui)實現了單神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)在全腦(nao)水平的(de)(de)(de)完整重構(gou)，以(yi)及透明化腦(nao)片中(zhong)間(jian)神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)的(de)(de)(de)形態重構(gou)。這一技(ji)術的(de)(de)(de)開發擴展了人們(men)在單神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)水平上(shang)解析大(da)腦(nao)結構(gou)的(de)(de)(de)能(neng)力，并(bing)有(you)助于在正(zheng)常和病理條件下繪制單神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)(yuan)(yuan)投(tou)射圖譜(pu)。

①雙AAV載(zai)體稀疏標記系統的設計原理
超新星（Supernova）載體通過(guo)tTA/TRE正(zheng)反饋表達機制(zhi)的泄(xie)露表達來稀疏(shu)和明亮地標記神經元，但缺乏細胞類型特異性，研究者在此(ci)基礎上進行改造，將一(yi)對正(zheng)交重組(zu)酶（Cre/Flp）與(yu)tTA/TRE正(zheng)反饋表達機制(zhi)相結(jie)合。
改進的稀疏標記系統由兩個AAV載體組成：①控制子（controller）：包含一個TRE啟動子和一個編碼Flp重組酶 (FLPo，其中“o”表示優化的版本)的Cre依賴的表達盒；②放大子（amplifier）：也使用TRE啟動子，但帶有一個編碼綠色熒光蛋白GFP和Tet轉錄激活因子tTA的Flp依賴的表達盒（圖1）。

圖1、雙AAV載體稀疏標記系統的設計原理

（Lin R., et al.,  Nat Methods, 2018.）

②雙AAV載體稀疏標記系統的工作原理
將兩(liang)種AAV載體混(hun)合后(hou)注射到(dao)表達(da)Cre的小鼠腦區，當病毒感染Cre陽性神(shen)經(jing)元后(hou)，控制子中Cre依賴的轉錄元件會被翻轉。但由于此時神經元細胞中沒有表達tTA，TRE啟動子轉錄活性極低，無法驅動FLPo的強烈表達，也就不能觸發放大子中Flp依賴的轉錄元件的翻轉。由于TRE啟動子低水平的滲漏表達，極少數Cre陽性神經元中FLPo的表達量達到一定的水平，進而能觸發放大子載體上Flp依賴的轉錄元件的翻轉，從而表達微量的GFP和tTA。此時，僅極少數細胞內tTA的表達量達到一定水平，觸發了放大子中Flp依賴的轉錄元件的翻轉。然后tTA水平足以與TRE啟動子結合，激活控制子和放大子載體上的轉錄元件表達，由此啟動了一個正反饋循環，進一步提高了GFP的表達水平，標記強度得到增強（圖2）。

圖2、雙AAV載體(ti)稀(xi)疏標記系(xi)統的工作原理

（Lin R., et al.,  Nat Methods, 2018.）

③雙AAV載體稀疏標記系統的優勢
1）由(you)于(yu)標(biao)(biao)記(ji)的(de)觸發依賴于(yu)Cre，通(tong)過(guo)將該稀疏標(biao)(biao)記(ji)系統與Cre轉基因小鼠聯(lian)用，可有效對大腦特定(ding)區域的(de)特定(ding)類型的(de)單個神經元(yuan)進行稀疏、明亮地標(biao)(biao)記(ji)；
2）通過調整控(kong)制子(zi)和放(fang)大子(zi)的混(hun)合(he)比例(li)，能(neng)夠(gou)控(kong)制標記(ji)的稀疏(shu)程(cheng)度(du)；
3）通過結合多種位點(dian)特異性(xing)重組酶可以(yi)建立(li)更多版本，有望實現更復(fu)雜的表達策略(lve)；
4）理論上，該系(xi)統(tong)可(ke)以(yi)與光遺傳學、分子探針(zhen)和基因編輯等元件聯(lian)用(yong)，用(yong)于單(dan)細胞水平功能性(xing)研究；
總而言之，雙(shuang)AAV稀(xi)疏標記系統這一技術的開(kai)發將(jiang)有助(zhu)于(yu)將(jiang)腦連接譜研(yan)究推(tui)向(xiang)單細胞精度，并有希望(wang)幫助(zhu)研(yan)究人員(yuan)在單細胞精度下對正(zheng)常及(ji)病理狀態(tai)的神經元進行研(yan)究。

④雙AAV載體稀疏標記系統的應用
借助雙AAV稀疏標記系統，研究者不僅可對中腦多巴胺神經元進行特異性標記，而且還可對單個神經元的特異性投射進行有效標記；此外，將該標記系統與熒光顯微光學切片斷層成像系統（fMOST）相結合，可建立一個包括細胞類型特異性稀疏標記、高分辨率全腦成像、形態學重建和定量分析的通道，在全腦水平上實現了進行定量單神經元重建的可能性。最后，將該稀疏標記系統與組織透明技術uDISCO結合使用，實現了對中間神經元的快速重構，并且可以高效地對神經元樹突的分支特征進行量化分析。詳情可下載原文進行查看：

維真生物部分雙AAV稀疏標記載體

維真(zhen)生(sheng)物擁有多(duo)種(zhong)雙AAV稀疏(shu)標(biao)(biao)記(ji)載體，可為您提(ti)供更高滴度(du)和純度(du)的AAV病毒，且具有多(duo)種(zhong)熒光蛋(dan)白的放大子(zi)，為您的單神經元稀疏(shu)標(biao)(biao)記(ji)助一(yi)臂之(zhi)力！

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參考文獻：

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