維真AAV病毒在高血壓腦出血中的應用
研究背景
高血(xue)壓(ya)腦(nao)(nao)(nao)出(chu)(chu)血(xue)是(shi)非常嚴重的一類(lei)高血(xue)壓(ya)并發癥，已成(cheng)為人(ren)類(lei)重大健康負擔。盡(jin)快(kuai)明確高血(xue)壓(ya)腦(nao)(nao)(nao)出(chu)(chu)血(xue)發病(bing)(bing)機制(zhi)以及(ji)干預(yu)(yu)中年人(ren)腦(nao)(nao)(nao)出(chu)(chu)血(xue)風險已刻不(bu)容緩。但目(mu)前(qian)針對高血(xue)壓(ya)腦(nao)(nao)(nao)出(chu)(chu)血(xue)相關發病(bing)(bing)機制(zhi)的研(yan)(yan)究(jiu)還很不(bu)成(cheng)熟(shu)，并且(qie)沒有針對預(yu)(yu)防腦(nao)(nao)(nao)出(chu)(chu)血(xue)的藥物投入臨床應用。中國醫(yi)學科(ke)學院(yuan)阜外醫(yi)院(yuan)陳敬洲教授團隊承擔題為“豆紋(wen)動脈神經復合體”區(qu)易發腦(nao)(nao)(nao)出(chu)(chu)血(xue)的遺傳(chuan)、環(huan)境危險因素及(ji)預(yu)(yu)警生物標志研(yan)(yan)究(jiu)”的973研(yan)(yan)究(jiu)項目(mu)，主要(yao)致力于高血(xue)壓(ya)腦(nao)(nao)(nao)出(chu)(chu)血(xue)的機制(zhi)研(yan)(yan)究(jiu)。
通(tong)(tong)過(guo)GEO數據庫，該(gai)團隊將人外周血(xue)管平(ping)滑(hua)肌細(xi)胞(bao)(bao)和內(nei)皮細(xi)胞(bao)(bao)外顯(xian)(xian)(xian)(xian)子芯片結果（GSE15805）與人腦(nao)血(xue)管平(ping)滑(hua)肌細(xi)胞(bao)(bao)和內(nei)皮細(xi)胞(bao)(bao)外顯(xian)(xian)(xian)(xian)子芯片結果（GSE19090）進行(xing)交叉比對后發現，包括Plod3（編(bian)碼賴氨酸羥化酶-3，LH3）在內(nei)的(de)多種基(ji)(ji)因(yin)在腦(nao)血(xue)管平(ping)滑(hua)肌的(de)表達(da)水(shui)平(ping)較(jiao)顱外平(ping)滑(hua)肌顯(xian)(xian)(xian)(xian)著降(jiang)低(di)，且(qie)在腦(nao)血(xue)管平(ping)滑(hua)肌中尤為明顯(xian)(xian)(xian)(xian)，進一步通(tong)(tong)過(guo)網絡通(tong)(tong)路分析發現該(gai)基(ji)(ji)因(yin)處(chu)于富(fu)集通(tong)(tong)路的(de)關(guan)鍵節點(dian)位置(zhi)，因(yin)此推(tui)測(ce)上述基(ji)(ji)因(yin)可能與高血(xue)壓腦(nao)出血(xue)血(xue)管病變密切(qie)相關(guan)。（文章(zhang)所用(yong)AAV9-LH3產(chan)品(pin)由維真生(sheng)物提供）
路線設計
首先(xian)該團(tuan)隊構建(jian)了小(xiao)(xiao)鼠高(gao)(gao)血(xue)壓(ya)腦(nao)出(chu)血(xue)模(mo)型，提取(qu)正(zheng)常對照組及(ji)(ji)(ji)高(gao)(gao)血(xue)壓(ya)腦(nao)出(chu)血(xue)組小(xiao)(xiao)鼠的腦(nao)血(xue)管RNA及(ji)(ji)(ji)蛋白(bai)，在mRNA水(shui)平及(ji)(ji)(ji)蛋白(bai)水(shui)平分別檢測發現，在高(gao)(gao)血(xue)壓(ya)腦(nao)出(chu)血(xue)時，小(xiao)(xiao)鼠腦(nao)血(xue)管Plod3顯著下調。因(yin)(yin)此，該團(tuan)隊認為Plod3基因(yin)(yin)在高(gao)(gao)血(xue)壓(ya)腦(nao)出(chu)血(xue)中可能發揮重要的保護作用。
部分成果展示
首(shou)先，研究者利(li)用AAV9- Plod3轉基(ji)因(yin)的(de)(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒載(zai)體(ti)，通(tong)過(guo)立體(ti)定位(wei)注射(she)的(de)(de)方法(fa)(fa)將病(bing)(bing)(bing)(bing)毒注射(she)入小鼠(shu)側(ce)腦(nao)室，4周后檢測病(bing)(bing)(bing)(bing)毒感染(ran)情況及LH3在(zai)腦(nao)血(xue)管(guan)的(de)(de)表達情況。結(jie)果如圖(tu)一所示，通(tong)過(guo)腦(nao)整(zheng)體(ti)切片(pian)檢測綠色(se)熒(ying)光蛋白，提取腦(nao)血(xue)管(guan)蛋白進行Western Blot以及免疫熒(ying)光多(duo)重(zhong)方法(fa)(fa)檢測，確認了LH3基(ji)因(yin)確實在(zai)小鼠(shu)全腦(nao)中的(de)(de)過(guo)表達。立體(ti)定位(wei)注射(she)分位(wei)置為前(qian)囟(xin)點后退0.2mm旁(pang)開1mm深2.7mm，注射(she)病(bing)(bing)(bing)(bing)毒體(ti)積為2μL。
圖一(yi)、AAV-LH3在(zai)小鼠全腦中的過表達
進(jin)而，采用血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)管緊張素（AngII）皮下埋泵的(de)(de)方法(fa)來(lai)構建小(xiao)鼠(shu)(shu)高(gao)(gao)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)壓模型，但(dan)前(qian)期預實驗結果提示(shi)，單純AngII輸注并(bing)不(bu)會引起小(xiao)鼠(shu)(shu)高(gao)(gao)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)壓腦(nao)出(chu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)的(de)(de)發(fa)(fa)生(sheng)，需要(yao)同時給予L-NAME，一(yi)種非選擇性內皮一(yi)氧(yang)化氮(dan)合酶(mei)抑制劑聯合應用，才能成功構建高(gao)(gao)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)壓腦(nao)出(chu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)模型。研究者進(jin)一(yi)步對各(ge)處(chu)理組(zu)(zu)高(gao)(gao)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)壓腦(nao)出(chu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)的(de)(de)發(fa)(fa)生(sheng)情況進(jin)行了生(sheng)存曲線描繪，結果顯示(shi)高(gao)(gao)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)壓腦(nao)出(chu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)組(zu)(zu)小(xiao)鼠(shu)(shu)28天時腦(nao)出(chu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)發(fa)(fa)生(sheng)率為80%，Plod3過表(biao)達組(zu)(zu)腦(nao)出(chu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)發(fa)(fa)生(sheng)率僅(jin)為30%，Plod3過表(biao)達組(zu)(zu)小(xiao)鼠(shu)(shu)腦(nao)出(chu)血(xue)(xue)(xue)(xue)(xue)發(fa)(fa)生(sheng)率顯著下降(jiang)，P<0.001。
圖二、LH3 過(guo)度表達可以改善細胞外基質重塑和炎癥過(guo)程(cheng)
隨后，該團隊對Plod3抑制(zhi)(zhi)高血(xue)(xue)(xue)壓腦(nao)出(chu)(chu)血(xue)(xue)(xue)的(de)機制(zhi)(zhi)進(jin)(jin)行了(le)深入(ru)探討。通(tong)過對腦(nao)出(chu)(chu)血(xue)(xue)(xue)前(qian)分離的(de)小鼠腦(nao)血(xue)(xue)(xue)管進(jin)(jin)行RNA-seq研究發現，Plod3主要通(tong)過抑制(zhi)(zhi)膠原(yuan)重塑、減(jian)(jian)少血(xue)(xue)(xue)管周(zhou)圍(wei)炎癥及抑制(zhi)(zhi)腦(nao)血(xue)(xue)(xue)管平滑肌細胞(bao)凋亡等多(duo)個層面減(jian)(jian)少高血(xue)(xue)(xue)壓腦(nao)出(chu)(chu)血(xue)(xue)(xue)的(de)發生風險及腦(nao)出(chu)(chu)血(xue)(xue)(xue)嚴重程度（如圖(tu)二(er)與圖(tu)三(san)所示(shi)）。
圖三、過表達LH3能(neng)顯著抑制血管平滑肌細胞的凋(diao)亡
本(ben)研(yan)究(jiu)已被國(guo)際(ji)腦(nao)卒中(zhong)研(yan)究(jiu)領域的頂級(ji)主(zhu)流(liu)期刊(kan)《Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism》接收，影響因子6.2。
圖四、過表達LH3抑制(zhi)腦出血模型
本課題(ti)的(de)(de)(de)最亮眼的(de)(de)(de)技(ji)術(shu)方法(fa)就是，利用維真生物公司構建的(de)(de)(de)AAV9過表達Plod3，通過立體定位注射技(ji)術(shu)，突破血(xue)(xue)腦屏障的(de)(de)(de)阻(zu)礙，在特定的(de)(de)(de)腦區高表達Plod3以(yi)達到抑制高血(xue)(xue)壓腦出(chu)血(xue)(xue)發生的(de)(de)(de)目的(de)(de)(de)。這(zhe)為(wei)臨床上高血(xue)(xue)壓腦出(chu)血(xue)(xue)的(de)(de)(de)預防手段(duan)提(ti)供了(le)新的(de)(de)(de)切入點，為(wei)生物醫學(xue)轉化(hua)找到了(le)新的(de)(de)(de)思路。
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