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AAV在心臟研究中的靶向策略【干貨篇】

心(xin)(xin)血(xue)(xue)管(guan)疾病(bing)是影響人(ren)類(lei)死(si)亡率的一個主要原(yuan)因(yin)。近年來，基(ji)因(yin)療法(fa)(fa)已成為治療和治愈(yu)受損心(xin)(xin)血(xue)(xue)管(guan)組織的一種有(you)前景的方(fang)法(fa)(fa)，能夠使心(xin)(xin)臟從(cong)無(wu)功(gong)能狀(zhuang)態恢復到(dao)正常狀(zhuang)態。AAV可在心(xin)(xin)臟組織有(you)效、持久、穩定、安(an)全地表(biao)達外源(yuan)基(ji)因(yin)，因(yin)而在心(xin)(xin)臟基(ji)因(yin)治療策略中占據獨特優勢。大量動物實驗和臨床數據表(biao)明，通過(guo)AAV攜帶治療基(ji)因(yin)對心(xin)(xin)血(xue)(xue)管(guan)疾病(bing)如(ru)心(xin)(xin)力衰竭(jie)、心(xin)(xin)肌缺血(xue)(xue)、心(xin)(xin)肌梗死(si)后心(xin)(xin)臟重構(gou)等均有(you)積(ji)極(ji)效果(guo)。在使用rAAV進行心臟(zang)研究時，正確選擇AAV血清型、啟(qi)動子(zi)以及注射方式是實驗順利(li)開展(zhan)的必備條件。今天小V就和(he)大家一起來學習(xi)一下(xia)AAV在(zai)心(xin)臟研(yan)究中的(de)優化策(ce)略，以提(ti)高AAV的(de)基因(yin)轉(zhuan)移效率(lv)。

01. 血清型的選擇

AAV血清型多種多樣，在心臟研究(jiu)中AAV1、AAV2、AAV6、AAV8和AAV9型對(dui)心臟有(you)較好的感染(ran)效(xiao)率，其(qi)中AAV8和AAV9的感染效率(lv)較優于其他血清型，AAV9是(shi)目(mu)前公認的(de)(de)高效特(te)異性(xing)靶(ba)向心臟表達的(de)(de)病毒載體(ti)血(xue)清型。盡管AAV8的(de)感染效果(guo)也不錯，但是沒有AAV9的(de)擴(kuo)散性好(hao)。臨床上靶向心肌的(de)AAV血清型(xing)一般為1，6和9型(xing)，其中AAV1和AAV6均可有(you)效靶向心肌(ji)和骨骼肌(ji)細胞，而AAV9則更加傾向于(yu)對心肌(ji)的感染。

圖1.五種AAV血清型對心臟感染效率檢測

圖(tu)2.不(bu)同血清型與不(bu)同病(bing)毒量感染心(xin)臟的效(xiao)果圖(tu)
（Prasad K et al. Gene Therapy, 2011）

02. 啟動子(zi)的選(xuan)擇

常(chang)見的(de)廣(guang)譜型啟動子CMV、CAG即可在(zai)心臟中較好表達，如(ru)果特異性要求(qiu)不高的(de)話可以選擇CMV啟(qi)動子(zi)，其(qi)對心(xin)臟的轉導(dao)效率(lv)很高。

圖3. AAV9-CMV與AAV9-CBA介導的心肌中GFP表達情況（1w、3w、5w、8w）
(■) CMV; (■) CBA.
（BD Chen et al. Clin Exp Pharmacol Physiol 2015）

若要(yao)實現目的基(ji)因在心臟中特異(yi)性表達，推薦選擇(ze)心臟特異(yi)性的啟動子，如cTNT、αMHC、Des、MLC2v等，其中(zhong)cTNT和(he)αMHC兩種啟動子應用較(jiao)為廣泛。

圖4.cTnT啟動(dong)子在心臟表(biao)達的特異性(xing)更強 （Prasad K,Xu Y, Yang Z,et al. Gene Therapy, 2011）

03. 注射方式的選擇

AAV在心臟(zang)的(de)注(zhu)射方式有多種，心肌原點注射(she)(she)、冠狀(zhuang)動脈注射(she)(she)、頸靜(jing)脈注射(she)(she)和尾靜(jing)脈注射(she)(she)均可以將藥物遞送到(dao)心(xin)臟，通常文獻報道較多(duo)的(de)是(shi)心肌(ji)原點注(zhu)射和尾(wei)靜脈(mo)注(zhu)射。

心肌注射：

心肌注(zhu)射是通過(guo)注(zhu)射器或類似裝置將(jiang)藥物直接注(zhu)入(ru)心臟(zang)組織，多采(cai)用原位多點注射方式(shi)，注射體積20μL/site，3-5點注射，通(tong)常(chang)注射的總病(bing)毒量在10E11VG以上。與血管注射相比，心(xin)肌(ji)直接注射方法特(te)異(yi)性較(jiao)強，可(ke)以實現(xian)對感興趣區(qu)域(yu)的(de)(de)高(gao)效(xiao)轉(zhuan)導，但表(biao)達(da)不均勻，只(zhi)在注射部位(wei)周(zhou)圍的(de)(de)區(qu)域(yu)進行表(biao)達(da)。

圖5.心(xin)肌注(zhu)射(she)（心(xin)外(wai)膜與(yu)心(xin)內膜途徑）與(yu)心(xin)包注(zhu)射(she) （Ishikawa K,et al. Journal of Gene Medicine,2011）

尾靜脈注(zhu)射：

是將小鼠固定后通過尾(wei)部側面的(de)靜脈注(zhu)(zhu)射使藥物傳遞到(dao)心臟(zang)。尾(wei)靜脈注(zhu)(zhu)射易于(yu)操(cao)作，但是特異性較心肌注(zhu)(zhu)射稍(shao)弱，注射體(ti)積(ji)在100μL-200μL左(zuo)右，由于載體(ti)在全身廣泛(fan)分布，注射(she)劑在血容量(liang)中(zhong)會被稀釋，所(suo)以通常需要較高的病毒滴(di)度(du)。

頸靜脈注射：

頸(jing)靜(jing)脈(mo)注(zhu)射時(shi)，在麻醉小鼠頸(jing)部做切(qie)口，并分離(li)頸(jing)靜(jing)脈(mo)，用31G針將載(zai)體注(zhu)入頸(jing)靜(jing)脈(mo)。此(ci)方法(fa)需(xu)要進行手(shou)術(shu)，操作要求較高，且對動物有傷害性。頸靜脈注射(she)時，所注射(she)的病毒總量約(yue)為20μL-100uL。

冠狀(zhuang)動脈注射：

冠狀(zhuang)動脈注(zhu)射又分(fen)順行冠(guan)狀動脈(mo)注射(she)和逆行冠(guan)狀動脈(mo)注射(she)。

順(shun)行冠狀(zhuang)動脈注射(she)是通過導管直接注射(she)載體，允許具有心臟(zang)選擇性的載(zai)體進(jin)行(xing)微創遞(di)送，由(you)于其微創性(xing)該方法具(ju)有較(jiao)大的優勢，已廣(guang)泛用于臨床和實驗基因治療研究。但由(you)于內皮細(xi)胞是(shi)載體(ti)到達心(xin)肌(ji)細(xi)胞的屏(ping)障，導致(zhi)轉導效率相對較(jiao)低，可以小劑量的持(chi)續注入或使(shi)用一些藥劑（如(ru)腺苷、組胺(an)類、硝酸甘(gan)油等）來(lai)增加(jia)血管(guan)床的滲透性(xing)進行(xing)改善。

圖6.順行冠狀動脈注(zhu)(zhu)射(she) A、順行注(zhu)(zhu)射(she)：通過導(dao)管直(zhi)接(jie)注(zhu)(zhu)射(she)載體(ti)；
B、使用(yong)V型聚(ju)焦系統(tong)進行(xing)(xing)順行(xing)(xing)注射(she)(she)：注射(she)(she)的載體通過(guo)抽吸(xi)導管從冠狀(zhuang)竇中吸(xi)出，然后(hou)再循環到冠狀(zhuang)動(dong)脈中；
C、冠狀動脈阻塞的順行注射：將載體(ti)注射到阻斷(duan)冠狀動脈血流的球囊(nang)遠端
（Ishikawa K et al. Journal of Gene Medicine, 2011）

逆(ni)行(xing)(xing)冠(guan)(guan)狀動脈注(zhu)射(she)是通過阻斷冠(guan)(guan)狀竇進行(xing)(xing)壓(ya)力調節的(de)逆(ni)向輸注(zhu)，相比(bi)順(shun)行(xing)(xing)注(zhu)射(she)更(geng)加(jia)有效。然(ran)而，這(zhe)種方法需要暫(zan)時中斷冠(guan)(guan)狀動脈血流，以消除順(shun)行(xing)(xing)血流對(dui)壓(ya)力的(de)影(ying)響。雖然(ran)轉導效率很高(gao)，但創傷較大，危險性較高(gao)。

圖7.通過冠(guan)狀竇逆行注射(she) A、逆行注射(she):載體在冠(guan)狀動脈(mo)阻塞時注入冠(guan)狀竇，冠(guan)狀竇的壓力由導(dao)管調節；
B、冠狀竇直接注射(she)(TransAccess):利用血管(guan)內超(chao)聲引導經靜脈心肌穿刺，載體由微導管(guan)通過可擴張(zhang)針進行注射(she)
（Ishikawa K et al. Journal of Gene Medicine, 2011）

幾(ji)種常用注射(she)方式的優劣勢(shi)比較

04. 參(can)考文(wen)獻

1. Prasad K , Xu Y , Yang Z , et al. Robust Cardiomyocyte-Specific Gene Expression Following Systemic Injection of AAV: In Vivo Gene Delivery Follows a Poisson Distribution[J]. Gene Therapy, 2011, 18(1):43-52.

2. Ishikawa K , Tilemann L , Fish K , et al. Gene delivery methods in cardiac gene therapy[J]. Journal of Gene Medicine, 2011, 13(10):566-572.

3. BD Chen , CH He , XC Chen , et al. Targeting transgene to the heart and liver with AAV9 by different promoters[J]. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, 2015, 42(10):1108-1117.

AAV在心臟研究(jiu)中的靶(ba)向策略(lve)【應用篇】（可點擊查看）