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AAV在心臟研究中的靶向策略【應用篇】

通過(guo)上一(yi)(yi)期AAV在(zai)心臟研究中(zhong)的(de)靶向(xiang)策(ce)(ce)略（干貨篇）對rAAV在(zai)心臟實驗中(zhong)的(de)啟動子、血清型(xing)以及注射方式的(de)選擇策(ce)(ce)略的(de)學習，相信(xin)大家(jia)對rAAV在(zai)心臟研究中(zhong)的(de)應(ying)(ying)用已有(you)所了(le)(le)解，今天小V將和大家(jia)一(yi)(yi)起，通過(guo)幾(ji)個案例深入了(le)(le)解一(yi)(yi)下關于AAV在(zai)心臟研究中(zhong)的(de)具體應(ying)(ying)用。

維真客戶AAV心臟注射實例 01
Zinc finger and BTB domain-containing protein 20 aggravates angiotensin II?induced cardiac remodeling via the EGFR?AKT pathway

ZBTB20（鋅指和BTB結構域蛋白20）是來自POK家族的轉錄因子，被證明在維持心臟收縮中發揮關鍵作用，但在心臟重構中的作用尚未被闡明。本研究中，作者用血管緊張素II（Ang II）誘導小鼠心臟重塑模型，探討ZBTB20在心臟重構中的作用。研究發現ZBTB20在Ang II誘導的心臟重塑和心肌細胞損傷反應中表達升高；AAV9（心肌注射）介導的ZBTB20過表達，可導(dao)致心(xin)(xin)(xin)壁肥厚、心(xin)(xin)(xin)室擴(kuo)張、纖維(wei)化增(zeng)加和射血分數降低，而敲低ZBTB20后(hou)可保護心(xin)(xin)(xin)肌細胞免(mian)受Ang II誘導(dao)的(de)(de)(de)肥大影響。從(cong)分子機(ji)制(zhi)來看，ZBTB20通(tong)(tong)過EGFR-Akt信號通(tong)(tong)路加重Ang II誘導(dao)的(de)(de)(de)心(xin)(xin)(xin)臟(zang)重塑反應，本研(yan)究闡明了(le)ZBTB20在不良心(xin)(xin)(xin)臟(zang)重構向心(xin)(xin)(xin)力衰(shuai)竭的(de)(de)(de)轉變(bian)中的(de)(de)(de)作用，并為(wei)誘導(dao)不良心(xin)(xin)(xin)臟(zang)重構的(de)(de)(de)分子機(ji)制(zhi)提(ti)供了(le)依據。

如圖1所示，使用AAV9病毒載體在小鼠心臟中過表達ZBTB20， ZBTB20-NS組和ZBTB20-Ang II組ZBTB20蛋白表達水平均明顯升高，并且(qie)ZBTB20-Ang II組(zu)的(de)ZBTB20蛋(dan)白表達水平高于ZBTB20-NS組(zu)。Ang II處(chu)理(li)四周(zhou)后(hou)，ZBTB20注射組(zu)較NC組(zu)心(xin)肺重量更高，同時小鼠左心(xin)室和心(xin)肌(ji)(ji)細胞肥(fei)大(da)增加，這提示ZBTB20組(zu)出現心(xin)肌(ji)(ji)肥(fei)大(da)和肺水腫。此外,多種不(bu)良心(xin)臟(zang)重構和纖(xian)維(wei)化分子標(biao)志物轉錄增加，血管周(zhou)圍和間質(zhi)纖(xian)維(wei)化變得更為(wei)嚴重，這些(xie)數(shu)據表明(ming)ZBTB20的(de)過(guo)表達促進了不(bu)良的(de)心(xin)臟(zang)重構發(fa)展為(wei)心(xin)力衰(shuai)竭。

圖1. ZBTB20的過表達加重了心臟重構

如圖2所示，使用AAV9 RNA干擾ZBTB20，WB檢測到ZBTB20蛋白水平大大降低。小(xiao)鼠(shu)心(xin)肌細(xi)胞經轉染ZBTB20 siRNA后肥大(da)反應明顯(xian)降低(di)，而且細(xi)胞表面積變小(xiao)，心(xin)臟重(zhong)構(gou)分子標志物(wu)Anp和β-Mhc的轉錄水平也有所(suo)降低(di)，表明敲低(di)ZBTB20可保護心(xin)肌細(xi)胞免受Ang II誘導的肥大(da)影響(xiang)。

圖2.敲低ZBTB20可保護心肌細胞免受Ang II誘導的肥大影響

維真客戶AAV心臟注射實例 02
MiR-590-5p inhibits pathological hypertrophy mediated heart failure by targeting RTN4

由各(ge)種心臟疾病(bing)導致(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)心力衰(shuai)竭（HF）是造成當今社會(hui)人(ren)群死亡(wang)的(de)(de)(de)(de)(de)主要原因之一，目前尚(shang)無特別(bie)有效的(de)(de)(de)(de)(de)治療方(fang)法，尋找(zhao)新的(de)(de)(de)(de)(de)標志物對HF的(de)(de)(de)(de)(de)診斷和治療具(ju)有重要意(yi)義。前期研究(jiu)發(fa)現(xian)miR-590-3p可(ke)顯著(zhu)增加(jia)幼鼠及成年大鼠心肌(ji)細胞的(de)(de)(de)(de)(de)增殖，并且(qie)在(zai)(zai)肺動脈(mo)高(gao)壓兒童(tong)患者上腔靜脈(mo)血液中(zhong)表(biao)達上調(diao)。網(wang)狀內皮(pi)素4（RTN4）被(bei)證實在(zai)(zai)肥(fei)厚性心肌(ji)病(bing)動物模(mo)型中(zhong)顯著(zhu)上調(diao)，同時(shi)參(can)與冠心病(bing)調(diao)控，可(ke)作為心衰(shuai)的(de)(de)(de)(de)(de)指標。此外，RTN4還(huan)是miR-590-5p的(de)(de)(de)(de)(de)預(yu)測(ce)下游靶點。基于這些研究(jiu)結果，研究(jiu)人(ren)員探索了miR-590-3p和RTN4在(zai)(zai)HF中(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)關系。

研究人員采用主動脈弓縮窄術制備小鼠HF模型，并對小鼠心力衰竭的的病理進程進行分析觀察，發現miR-590-5p在HF小鼠心臟組織中表達下調,尾靜脈注射AAV9-miR-590-5p可減輕心肌肥厚和心肌細胞凋亡。此外，miR-590-5p過表達可促進H9C2細胞(bao)活力(li)，抑制(zhi)細胞(bao)凋亡，降低(di)心(xin)(xin)(xin)(xin)肌(ji)(ji)重塑水平。機制(zhi)上，miR-590-5p結合(he)到RTN4 3 'UTR，通過負調控(kong)RTN4 調節(jie)心(xin)(xin)(xin)(xin)肌(ji)(ji)細胞(bao)表型。綜(zong)上所述，miR-590-5p通過下調RTN4調控(kong)HF心(xin)(xin)(xin)(xin)肌(ji)(ji)肥厚和心(xin)(xin)(xin)(xin)肌(ji)(ji)細胞(bao)凋亡。

如圖3所示，通過RT-qPCR驗證AAV9-miR-590-5p在小鼠中的表達大幅提高。miR-590-5p的(de)過(guo)表(biao)達降低(di)了小鼠(shu)LVEDD（左心(xin)(xin)室舒張末期內(nei)徑），減(jian)輕了小鼠(shu)心(xin)(xin)肌(ji)的(de)水腫和(he)肥(fei)厚(hou)。此(ci)外，miR-590-5p的(de)過(guo)表(biao)達還顯(xian)著降低(di)了小鼠(shu)心(xin)(xin)臟組織ANF、BNP和(he)β-MHC(心(xin)(xin)臟重構標志物(wu))的(de)蛋白(bai)水平，同時使(shi)Bcl-2（細(xi)胞凋亡(wang)抑制基因）蛋白(bai)水平升高及Bax（細(xi)胞凋亡(wang)促進基因）蛋白(bai)水平降低(di)。綜上所述(shu)，miR-590-5p過(guo)表(biao)達可減(jian)輕HF模型小鼠(shu)的(de)心(xin)(xin)肌(ji)肥(fei)厚(hou)和(he)心(xin)(xin)功(gong)能障礙。

圖3. MiR-590-5p過表達可減輕HF模型小鼠的心肌肥厚和心功能障礙

維真客戶AAV心臟注射實例 03
The deubiquitinase UCHL1 regulates cardiac hypertrophy by stabilizing epidermal growth factor receptor

病理性(xing)心臟肥(fei)大可導致心力衰(shuai)竭。研究證實在促心肌(ji)肥(fei)厚途(tu)徑中表皮生長因(yin)子(zi)受(shou)體（EGFR或ErbB1）是(shi)正調(diao)(diao)控因(yin)子(zi)，EGFR的穩定性(xing)、轉運和(he)激活主要受(shou)翻譯后(hou)修飾(shi)的調(diao)(diao)控，然而其(qi)具體調(diao)(diao)控機制(zhi)尚不完(wan)全清楚。研究表明去(qu)泛素(su)化酶UCHL1在心肌(ji)梗死后(hou)的心肌(ji)細胞中表達高度上調(diao)(diao)，但是(shi)人們(men)對其(qi)在調(diao)(diao)節心肌(ji)肥(fei)厚和(he)重構中的作(zuo)用知之(zhi)甚少。

在本研究中，研究者通過功能缺失和功能獲得的方法并使用抑制劑，證實UCHL1在激動劑誘導的心肌肥厚細胞及衰竭心臟中表達上調，過表達UCHL1（AAV9，尾靜脈注射）可加(jia)速壓(ya)(ya)力(li)超(chao)負(fu)(fu)荷(he)誘導的(de)心(xin)肌肥(fei)厚(hou)，而(er)下調(diao)UCHL1則可顯著(zhu)改善由激動劑或(huo)壓(ya)(ya)力(li)超(chao)負(fu)(fu)荷(he)引起的(de)心(xin)肌肥(fei)厚(hou)；同時闡明了UCHL1通過(guo)降(jiang)低EGFR泛(fan)素化(hua)和降(jiang)解正向(xiang)調(diao)節心(xin)肌肥(fei)厚(hou)，全(quan)身(shen)給藥UCHL1抑制劑可顯著(zhu)逆轉心(xin)肌肥(fei)厚(hou)和重構。綜(zong)上所(suo)述，這些發現表明UCHL1在心(xin)肌肥(fei)厚(hou)的(de)發病機(ji)制中(zhong)發揮重要作(zuo)用，可作(zuo)為肥(fei)厚(hou)治療的(de)靶點。

如圖4所示，利用AAV9載體在小鼠心臟中過表達UCHL1，熒光顯微鏡檢測顯示心臟細胞得到高效感染，免疫印跡分析顯示心臟中UCHL1蛋白水平大大提高。

圖4. AAV9在小鼠心臟內高效傳遞

與rAAV9-GFP對(dui)照組(zu)相比，UCHL1的(de)過表達導(dao)致TAC術后小(xiao)鼠發(fa)生更(geng)嚴重(zhong)的(de)心(xin)(xin)功能障礙，且死亡率明(ming)顯增加(jia)。此外在UCHL1表達增加(jia)的(de)同時，EGFR蛋白水平、小(xiao)鼠心(xin)(xin)肌中磷酸化的(de)EGFR、AKT和ERK1/2（促心(xin)(xin)肌肥厚因子）也(ye)顯著升高，表明(ming)心(xin)(xin)臟(zang)中過表達UCHL1可(ke)加(jia)重(zhong)心(xin)(xin)肌肥厚，并可(ke)能與EGFR的(de)穩定性(xing)有(you)關(guan)（圖5）。

圖5. 過表達UCHL1可加速TAC術后小鼠的心肌肥厚

維真客戶AAV心臟注射實例 04
Oleic Acid Attenuates Ang II (Angiotensin II)-Induced Cardiac Remodeling by Inhibiting FGF23 (Fibroblast Growth Factor 23) Expression in Mice

高(gao)(gao)血(xue)壓(ya)可(ke)損傷(shang)多種(zhong)靶器官，研究表明在輕(qing)度至中度高(gao)(gao)血(xue)壓(ya)人群中左心(xin)(xin)室(shi)肥厚（LVH）患病率(lv)為20%至50%。然而，高(gao)(gao)血(xue)壓(ya)心(xin)(xin)臟重(zhong)構的病理機制仍知之(zhi)甚(shen)少。油酸(suan)（OA）是一種(zhong)重(zhong)要的單不(bu)飽和脂肪(fang)酸(suan)，據報道富(fu)含OA的地(di)中海飲食可(ke)降低心(xin)(xin)血(xue)管在內的多種(zhong)疾病的發(fa)生率(lv)，但其在高(gao)(gao)血(xue)壓(ya)性心(xin)(xin)臟重(zhong)塑中的作用(yong)及機制尚不(bu)清楚。

本研究(jiu)中(zhong)(zhong)作(zuo)者(zhe)對OA在高血(xue)(xue)壓(ya)性心(xin)(xin)臟(zang)(zang)重(zhong)塑中(zhong)(zhong)的(de)(de)作(zuo)用(yong)進行了探討。通過檢(jian)測(ce)伴(ban)有和(he)不伴(ban)有LVH高血(xue)(xue)壓(ya)患(huan)者(zhe)的(de)(de)血(xue)(xue)漿代(dai)謝譜(pu)，研究(jiu)人(ren)員(yuan)發現(xian)伴(ban)LVH高血(xue)(xue)壓(ya)患(huan)者(zhe)的(de)(de)外周血(xue)(xue)中(zhong)(zhong)OA水平顯著降(jiang)低，并先后通過體外及體內(nei)研究(jiu)證實OA可顯著降(jiang)低Ang II(血(xue)(xue)管緊張素II)誘導的(de)(de)心(xin)(xin)肌(ji)細(xi)(xi)胞(bao)生長、心(xin)(xin)肌(ji)成纖(xian)維細(xi)(xi)胞(bao)膠原表(biao)(biao)達和(he)小鼠心(xin)(xin)臟(zang)(zang)重(zhong)塑。RNA測(ce)序進一步發現(xian)FGF23(成纖(xian)維細(xi)(xi)胞(bao)生長因(yin)子23)在Ang II誘導反(fan)應中(zhong)(zhong)表(biao)(biao)達顯著上(shang)調，而在OA處理(li)后表(biao)(biao)達明顯受抑。利用(yong)AAV9載體過表(biao)(biao)達FGF23可加(jia)重(zhong)Ang II誘導的(de)(de)心(xin)(xin)臟(zang)(zang)重(zhong)塑，并削弱OA對心(xin)(xin)臟(zang)(zang)重(zhong)塑的(de)(de)保護作(zuo)用(yong)，進一步研究(jiu)發現(xian)OA通過阻斷Nurr1(核受體相關蛋(dan)白(bai))從細(xi)(xi)胞(bao)質(zhi)到細(xi)(xi)胞(bao)核的(de)(de)易位抑制Ang II誘導的(de)(de)FGF23表(biao)(biao)達，深(shen)入揭示了OA在防止Ang II誘導的(de)(de)心(xin)(xin)臟(zang)(zang)重(zhong)塑中(zhong)(zhong)發揮(hui)關鍵作(zuo)用(yong)。

通過尾靜脈注射將AAV9-FGF23及AAV9-GFP載體注入小鼠體內，熒光顯微鏡及WB檢測顯示AAV9病毒高效傳遞至小鼠心臟，FGF23蛋白在心臟組織中成功過表達（圖6）。FGF23在心(xin)臟組織中的(de)過(guo)表達加重(zhong)了(le)Ang II誘(you)導的(de)心(xin)功(gong)能障(zhang)礙，并損害了(le)OA對(dui)心(xin)臟重(zhong)構及心(xin)肌纖維(wei)化的(de)保護作用。

圖5. 過表達UCHL1可加速TAC術后小鼠的心肌肥厚

圖6. AAV9注射3周后小鼠心臟組織熒光結果及FGF23蛋白水平檢測

維真客戶AAV心臟注射實例 05
Redd1 protects against post?infarction cardiac dysfunction by targeting apoptosis and autophagy

心肌(ji)(ji)梗(geng)(geng)死(si)（MI）是全球(qiu)發病率(lv)和(he)死(si)亡率(lv)最高的(de)(de)心臟疾病之一，梗(geng)(geng)死(si)后會發生(sheng)(sheng)心肌(ji)(ji)重(zhong)塑并可(ke)能(neng)導(dao)致心力(li)衰竭(jie)。目前，藥物(wu)干預(yu)仍是預(yu)防梗(geng)(geng)死(si)后心臟重(zhong)塑和(he)功能(neng)障礙的(de)(de)有效治療方法，因(yin)此(ci)，尋找有效的(de)(de)干預(yu)靶點，減輕心肌(ji)(ji)梗(geng)(geng)死(si)后心臟重(zhong)構，從而防止梗(geng)(geng)死(si)后患者(zhe)心力(li)衰竭(jie)的(de)(de)發展是至關(guan)重(zhong)要(yao)的(de)(de)。據報道，細胞凋亡和(he)自噬(shi)參與心肌(ji)(ji)組織(zhi)發生(sheng)(sheng)的(de)(de)生(sheng)(sheng)理(li)過程，而且哺乳動物(wu)雷帕(pa)霉素靶蛋(dan)白(mTOR)被證實在(zai)許多心臟病中可(ke)同時調節(jie)凋亡和(he)自噬(shi)相(xiang)關(guan)的(de)(de)發病機(ji)制，但其(qi)具體(ti)調控機(ji)制尚不清(qing)楚。發育及DNA損傷反應調節(jie)基因(yin)1（Redd1）參與mTOR活性調節(jie)，但其(qi)在(zai)心臟中的(de)(de)作(zuo)用知之甚少。

在本(ben)研(yan)究(jiu)(jiu)中(zhong)，作(zuo)者首先檢測了(le)(le)MI小鼠(shu)心(xin)(xin)(xin)臟中(zhong)Redd1的(de)(de)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)情況(kuang)，發(fa)現Redd1表(biao)(biao)達(da)(da)(da)量下調。進(jin)一步使(shi)用AAV9介導Redd1過(guo)(guo)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)發(fa)現Redd1的(de)(de)過(guo)(guo)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)改(gai)善了(le)(le)小鼠(shu)左心(xin)(xin)(xin)室功(gong)能障礙，降(jiang)低了(le)(le)擴張指數，并(bing)抑(yi)制了(le)(le)心(xin)(xin)(xin)肌(ji)細胞凋亡及改(gai)善了(le)(le)自(zi)噬(shi)。此外，研(yan)究(jiu)(jiu)發(fa)現過(guo)(guo)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)Redd1可以抑(yi)制mTOR及其下游(you)效(xiao)應蛋白的(de)(de)磷酸化，進(jin)而緩解缺血損傷引起的(de)(de)心(xin)(xin)(xin)室功(gong)能障礙。綜上所述(shu)，本(ben)研(yan)究(jiu)(jiu)證明Redd1過(guo)(guo)表(biao)(biao)達(da)(da)(da)通(tong)過(guo)(guo)mTOR信號(hao)通(tong)路減少細胞凋亡和(he)增強自(zi)噬(shi)來保(bao)護心(xin)(xin)(xin)肌(ji)梗死后心(xin)(xin)(xin)力衰竭(jie)的(de)(de)發(fa)生和(he)持續，深入揭示了(le)(le)Redd1是心(xin)(xin)(xin)肌(ji)梗死后心(xin)(xin)(xin)力衰竭(jie)發(fa)展的(de)(de)治療靶點。

研究人員通過尾靜脈注射AAV9載體上調Redd1的表達，發現小鼠心肌細胞中Redd1表達量顯著上升。Redd1的過表達顯(xian)著降低了LVEDd和LVESd，大(da)大(da)提高了LVEF 和LVFS水平(ping)(ping)，并使ANP和BNP mRNA水平(ping)(ping)大(da)幅(fu)下(xia)降，同(tong)時β-MHC mRNA水平(ping)(ping)也(ye)略有(you)下(xia)降。總的來說，Redd1過表達在心(xin)肌梗死后對心(xin)功(gong)能障礙和心(xin)臟擴張有(you)保(bao)護作用。

圖7. Redd1過表達可預防心肌梗死后心功能不全

維真客戶AAV心臟注射實例 06
Downregulation of miR-146a Contributes to Cardiac Dysfunction Induced by the Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib

 舒尼(ni)替尼(ni)（SNT）等酪氨酸激酶抑制劑可以顯著(zhu)提(ti)高(gao)癌(ai)癥患(huan)者的(de)(de)預期(qi)壽命，但是(shi)這些藥物的(de)(de)使用(yong)可能(neng)會引發心(xin)臟(zang)收縮功能(neng)障礙、高(gao)血(xue)壓、慢性心(xin)力(li)衰竭(jie)等心(xin)血(xue)管方(fang)面的(de)(de)不良反應。然而(er)，這種作(zuo)用(yong)的(de)(de)分子機制仍然不清楚。MicroRNA是(shi)心(xin)血(xue)管疾(ji)病和(he)酪氨酸激酶途徑(jing)中的(de)(de)關鍵調控因子，已被證實在心(xin)血(xue)管疾(ji)病中發揮著(zhu)關鍵作(zuo)用(yong)。MicroRNA的(de)(de)過表達和(he)下調可能(neng)是(shi)治(zhi)療心(xin)臟(zang)病患(huan)者的(de)(de)一(yi)種有效方(fang)法。

研(yan)究人員使用miRNA芯(xin)片(pian)分(fen)析了(le)舒尼(ni)替(ti)尼(ni)處理(li)后小(xiao)鼠心(xin)肌(ji)中miRNA的(de)差異表達，發現miR-146a顯著下(xia)調(diao)。利(li)用熒光素酶報告基因(yin)檢測實驗證實miR-146a的(de)下(xia)游靶點為Pln和Ank2，二者與心(xin)臟收縮功能(neng)障(zhang)(zhang)礙密切(qie)相(xiang)關。體內(nei)外實驗結果表明SNT下(xia)調(diao)miR-146a的(de)表達，并通過調(diao)控下(xia)游靶點PLN和ANK2導(dao)致心(xin)臟收縮功能(neng)障(zhang)(zhang)礙，上(shang)調(diao)miR-146a可緩解SNT對(dui)心(xin)臟收縮力的(de)抑制作用。本(ben)研(yan)究揭示了(le)miR-146a可能(neng)是一種有效的(de)SNT誘導(dao)的(de)心(xin)臟功能(neng)障(zhang)(zhang)礙的(de)保護劑。

如圖8所示，研究人員使用心臟特異性啟動子cTNT驅動的AAV9載體在小鼠心臟特異表達miR-146a，不同組織的熒光圖像表明，靜脈注射病毒載體后僅心臟被高效感染。通過超聲心動圖檢測心臟收縮(suo)功(gong)能(neng)，結果表(biao)明(ming)心臟中(zhong)miR-146a的(de)(de)過表(biao)達顯著(zhu)抑制(zhi)了SNT誘導的(de)(de)EF和FS降低(di)，表(biao)明(ming)心臟功(gong)能(neng)得到改善。

圖8. 體內過表達miR-146a可減輕SNT誘導的心肌收縮功能障礙