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AAV在心臟研究中的靶向策略【應用篇】

通過上(shang)一期AAV在(zai)心臟(zang)研究中(zhong)的(de)靶向策(ce)略（干貨(huo)篇）對rAAV在(zai)心臟(zang)實驗中(zhong)的(de)啟動子、血清型以(yi)及注射(she)方(fang)式的(de)選(xuan)擇策(ce)略的(de)學習，相(xiang)信大(da)家對rAAV在(zai)心臟(zang)研究中(zhong)的(de)應用已(yi)有所了解，今天(tian)小(xiao)V將和大(da)家一起，通過幾個案例深入(ru)了解一下關(guan)于(yu)AAV在(zai)心臟(zang)研究中(zhong)的(de)具體應用。

維真客戶AAV心臟注射實例 01
Zinc finger and BTB domain-containing protein 20 aggravates angiotensin II?induced cardiac remodeling via the EGFR?AKT pathway

ZBTB20（鋅指和BTB結構域蛋白20）是來自POK家族的轉錄因子，被證明在維持心臟收縮中發揮關鍵作用，但在心臟重構中的作用尚未被闡明。本研究中，作者用血管緊張素II（Ang II）誘導小鼠心臟重塑模型，探討ZBTB20在心臟重構中的作用。研究發現ZBTB20在Ang II誘導的心臟重塑和心肌細胞損傷反應中表達升高；AAV9（心肌注射）介導的ZBTB20過表達，可導(dao)(dao)致(zhi)心(xin)壁肥(fei)厚、心(xin)室擴(kuo)張、纖維化增加和射血分(fen)數降低(di)，而敲低(di)ZBTB20后可保(bao)護(hu)心(xin)肌細胞免(mian)受Ang II誘導(dao)(dao)的(de)肥(fei)大影響。從分(fen)子機制來看，ZBTB20通過EGFR-Akt信(xin)號通路加重Ang II誘導(dao)(dao)的(de)心(xin)臟重塑反應，本(ben)研究闡明了(le)ZBTB20在(zai)不(bu)良心(xin)臟重構向心(xin)力衰竭的(de)轉變中的(de)作用，并(bing)為誘導(dao)(dao)不(bu)良心(xin)臟重構的(de)分(fen)子機制提(ti)供了(le)依(yi)據。

如圖1所示，使用AAV9病毒載體在小鼠心臟中過表達ZBTB20， ZBTB20-NS組和ZBTB20-Ang II組ZBTB20蛋白表達水平均明顯升高，并且ZBTB20-Ang II組的ZBTB20蛋白表達(da)水(shui)平(ping)高于ZBTB20-NS組。Ang II處(chu)理四(si)周后，ZBTB20注射組較NC組心(xin)(xin)(xin)肺重量更高，同時小(xiao)鼠左心(xin)(xin)(xin)室和心(xin)(xin)(xin)肌細胞肥大(da)增(zeng)加，這(zhe)提(ti)示ZBTB20組出(chu)現心(xin)(xin)(xin)肌肥大(da)和肺水(shui)腫。此外,多種不(bu)良心(xin)(xin)(xin)臟(zang)(zang)重構和纖(xian)維化分子(zi)標志物轉錄增(zeng)加，血管周圍和間質纖(xian)維化變得更為(wei)嚴重，這(zhe)些數據表明ZBTB20的過表達(da)促進了不(bu)良的心(xin)(xin)(xin)臟(zang)(zang)重構發展(zhan)為(wei)心(xin)(xin)(xin)力衰(shuai)竭。

圖1. ZBTB20的過表達加重了心臟重構

如圖2所示，使用AAV9 RNA干擾ZBTB20，WB檢測到ZBTB20蛋白水平大大降低。小鼠心(xin)(xin)肌細胞經轉染ZBTB20 siRNA后(hou)肥大反應明顯(xian)降低(di)，而且細胞表面積變小，心(xin)(xin)臟重構分子標志物Anp和β-Mhc的轉錄水平也有所降低(di)，表明敲低(di)ZBTB20可保護心(xin)(xin)肌細胞免受(shou)Ang II誘導的肥大影響。

圖2.敲低ZBTB20可保護心肌細胞免受Ang II誘導的肥大影響

維真客戶AAV心臟注射實例 02
MiR-590-5p inhibits pathological hypertrophy mediated heart failure by targeting RTN4

由各種心(xin)臟疾(ji)病(bing)導致的(de)(de)(de)(de)心(xin)力衰(shuai)竭(jie)（HF）是(shi)造(zao)成當(dang)今社會人群死亡的(de)(de)(de)(de)主要原因之一，目(mu)前(qian)尚無特別有(you)(you)效的(de)(de)(de)(de)治(zhi)療方法，尋找新的(de)(de)(de)(de)標志物對(dui)HF的(de)(de)(de)(de)診(zhen)斷和治(zhi)療具有(you)(you)重要意義。前(qian)期研(yan)究發現miR-590-3p可顯(xian)(xian)著(zhu)增加幼鼠及成年大鼠心(xin)肌細胞的(de)(de)(de)(de)增殖，并且在(zai)(zai)肺動脈高壓(ya)兒童患者上腔靜脈血液中(zhong)表達上調。網(wang)狀內皮素4（RTN4）被證(zheng)實(shi)在(zai)(zai)肥厚(hou)性心(xin)肌病(bing)動物模(mo)型中(zhong)顯(xian)(xian)著(zhu)上調，同時參與冠心(xin)病(bing)調控，可作(zuo)為(wei)心(xin)衰(shuai)的(de)(de)(de)(de)指標。此外，RTN4還是(shi)miR-590-5p的(de)(de)(de)(de)預測下游靶點(dian)。基于這些研(yan)究結果(guo)，研(yan)究人員探索(suo)了miR-590-3p和RTN4在(zai)(zai)HF中(zhong)的(de)(de)(de)(de)關系。

研究人員采用主動脈弓縮窄術制備小鼠HF模型，并對小鼠心力衰竭的的病理進程進行分析觀察，發現miR-590-5p在HF小鼠心臟組織中表達下調,尾靜脈注射AAV9-miR-590-5p可減輕心肌肥厚和心肌細胞凋亡。此外，miR-590-5p過(guo)(guo)表(biao)達可促(cu)進H9C2細(xi)胞(bao)(bao)活力，抑制細(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)(wang)，降低心(xin)肌(ji)重塑水平。機制上，miR-590-5p結合(he)到RTN4 3 'UTR，通(tong)過(guo)(guo)負調(diao)控RTN4 調(diao)節(jie)心(xin)肌(ji)細(xi)胞(bao)(bao)表(biao)型。綜上所述(shu)，miR-590-5p通(tong)過(guo)(guo)下調(diao)RTN4調(diao)控HF心(xin)肌(ji)肥厚和心(xin)肌(ji)細(xi)胞(bao)(bao)凋亡(wang)(wang)。

如圖3所示，通過RT-qPCR驗證AAV9-miR-590-5p在小鼠中的表達大幅提高。miR-590-5p的(de)(de)(de)過表(biao)(biao)達(da)(da)降低(di)了小(xiao)鼠(shu)LVEDD（左心室舒張末(mo)期內徑），減輕(qing)(qing)了小(xiao)鼠(shu)心肌的(de)(de)(de)水(shui)(shui)腫和(he)(he)肥厚(hou)。此外，miR-590-5p的(de)(de)(de)過表(biao)(biao)達(da)(da)還顯(xian)著降低(di)了小(xiao)鼠(shu)心臟組織(zhi)ANF、BNP和(he)(he)β-MHC(心臟重構標(biao)志(zhi)物)的(de)(de)(de)蛋(dan)白水(shui)(shui)平(ping)，同時使Bcl-2（細胞凋亡抑制(zhi)基因）蛋(dan)白水(shui)(shui)平(ping)升高及Bax（細胞凋亡促進(jin)基因）蛋(dan)白水(shui)(shui)平(ping)降低(di)。綜上(shang)所述，miR-590-5p過表(biao)(biao)達(da)(da)可減輕(qing)(qing)HF模型小(xiao)鼠(shu)的(de)(de)(de)心肌肥厚(hou)和(he)(he)心功能障礙。

圖3. MiR-590-5p過表達可減輕HF模型小鼠的心肌肥厚和心功能障礙

維真客戶AAV心臟注射實例 03
The deubiquitinase UCHL1 regulates cardiac hypertrophy by stabilizing epidermal growth factor receptor

病理性心(xin)臟肥大可導(dao)致心(xin)力衰竭。研(yan)究證(zheng)實在促心(xin)肌肥厚(hou)途(tu)徑中(zhong)表皮(pi)生長因子受體（EGFR或ErbB1）是(shi)正調(diao)控因子，EGFR的穩定性、轉(zhuan)運和激活主要受翻譯后(hou)修飾(shi)的調(diao)控，然(ran)而其具體調(diao)控機制尚不(bu)完全清楚。研(yan)究表明去泛素化酶UCHL1在心(xin)肌梗(geng)死后(hou)的心(xin)肌細胞中(zhong)表達高度(du)上(shang)調(diao)，但(dan)是(shi)人們對其在調(diao)節(jie)心(xin)肌肥厚(hou)和重(zhong)構中(zhong)的作用知之甚(shen)少。

在本研究中，研究者通過功能缺失和功能獲得的方法并使用抑制劑，證實UCHL1在激動劑誘導的心肌肥厚細胞及衰竭心臟中表達上調，過表達UCHL1（AAV9，尾靜脈注射）可加(jia)速壓力超負荷誘導的心肌(ji)肥(fei)(fei)(fei)厚，而(er)下調(diao)UCHL1則可顯著改善由激動(dong)劑(ji)或壓力超負荷引起的心肌(ji)肥(fei)(fei)(fei)厚；同時(shi)闡明了(le)UCHL1通過降低EGFR泛(fan)素(su)化和降解(jie)正向調(diao)節(jie)心肌(ji)肥(fei)(fei)(fei)厚，全身給藥UCHL1抑制劑(ji)可顯著逆轉心肌(ji)肥(fei)(fei)(fei)厚和重構。綜上所述，這些發現表明UCHL1在心肌(ji)肥(fei)(fei)(fei)厚的發病機制中發揮重要作用，可作為肥(fei)(fei)(fei)厚治(zhi)療的靶點。

如圖4所示，利用AAV9載體在小鼠心臟中過表達UCHL1，熒光顯微鏡檢測顯示心臟細胞得到高效感染，免疫印跡分析顯示心臟中UCHL1蛋白水平大大提高。

圖4. AAV9在小鼠心臟內高效傳遞

與(yu)rAAV9-GFP對(dui)照(zhao)組相比，UCHL1的(de)過表(biao)達導致TAC術后小鼠發(fa)生更嚴重(zhong)的(de)心(xin)功能(neng)障礙(ai)，且死亡(wang)率明顯增加。此外在UCHL1表(biao)達增加的(de)同時，EGFR蛋白(bai)水平(ping)、小鼠心(xin)肌中磷酸化的(de)EGFR、AKT和(he)ERK1/2（促心(xin)肌肥厚因(yin)子）也(ye)顯著升(sheng)高，表(biao)明心(xin)臟(zang)中過表(biao)達UCHL1可加重(zhong)心(xin)肌肥厚，并(bing)可能(neng)與(yu)EGFR的(de)穩定性有關（圖5）。

圖5. 過表達UCHL1可加速TAC術后小鼠的心肌肥厚

維真客戶AAV心臟注射實例 04
Oleic Acid Attenuates Ang II (Angiotensin II)-Induced Cardiac Remodeling by Inhibiting FGF23 (Fibroblast Growth Factor 23) Expression in Mice

高(gao)血(xue)壓可損傷多種(zhong)靶器官(guan)，研究(jiu)表明在(zai)輕度至中度高(gao)血(xue)壓人群中左心(xin)室肥厚（LVH）患病率為20%至50%。然而，高(gao)血(xue)壓心(xin)臟(zang)重構的(de)(de)病理機制(zhi)(zhi)仍(reng)知之(zhi)甚少。油酸(suan)（OA）是一種(zhong)重要的(de)(de)單(dan)不(bu)飽和脂(zhi)肪(fang)酸(suan)，據報(bao)道富(fu)含(han)OA的(de)(de)地中海飲食可降低心(xin)血(xue)管在(zai)內的(de)(de)多種(zhong)疾(ji)病的(de)(de)發生率，但其(qi)在(zai)高(gao)血(xue)壓性(xing)心(xin)臟(zang)重塑中的(de)(de)作用及機制(zhi)(zhi)尚(shang)不(bu)清(qing)楚。

本研(yan)究(jiu)中作者(zhe)對OA在高血(xue)(xue)壓(ya)性(xing)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)(zang)重(zhong)塑(su)中的(de)(de)作用(yong)(yong)進(jin)行了探討。通(tong)(tong)過檢測(ce)伴(ban)(ban)(ban)有和(he)不伴(ban)(ban)(ban)有LVH高血(xue)(xue)壓(ya)患(huan)者(zhe)的(de)(de)血(xue)(xue)漿代謝譜，研(yan)究(jiu)人員發現伴(ban)(ban)(ban)LVH高血(xue)(xue)壓(ya)患(huan)者(zhe)的(de)(de)外周血(xue)(xue)中OA水平顯著(zhu)(zhu)降低，并(bing)先后通(tong)(tong)過體(ti)外及體(ti)內研(yan)究(jiu)證實OA可顯著(zhu)(zhu)降低Ang II(血(xue)(xue)管緊張素II)誘(you)導(dao)(dao)的(de)(de)心(xin)肌細(xi)(xi)(xi)胞生長、心(xin)肌成纖維細(xi)(xi)(xi)胞膠原表(biao)達(da)和(he)小鼠心(xin)臟(zang)(zang)(zang)(zang)重(zhong)塑(su)。RNA測(ce)序進(jin)一(yi)步發現FGF23(成纖維細(xi)(xi)(xi)胞生長因子(zi)23)在Ang II誘(you)導(dao)(dao)反(fan)應中表(biao)達(da)顯著(zhu)(zhu)上調，而在OA處理后表(biao)達(da)明顯受抑。利(li)用(yong)(yong)AAV9載體(ti)過表(biao)達(da)FGF23可加(jia)重(zhong)Ang II誘(you)導(dao)(dao)的(de)(de)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)(zang)重(zhong)塑(su)，并(bing)削弱OA對心(xin)臟(zang)(zang)(zang)(zang)重(zhong)塑(su)的(de)(de)保護作用(yong)(yong)，進(jin)一(yi)步研(yan)究(jiu)發現OA通(tong)(tong)過阻斷Nurr1(核(he)受體(ti)相關蛋白)從細(xi)(xi)(xi)胞質到細(xi)(xi)(xi)胞核(he)的(de)(de)易位抑制Ang II誘(you)導(dao)(dao)的(de)(de)FGF23表(biao)達(da)，深入揭示了OA在防(fang)止Ang II誘(you)導(dao)(dao)的(de)(de)心(xin)臟(zang)(zang)(zang)(zang)重(zhong)塑(su)中發揮關鍵作用(yong)(yong)。

通過尾靜脈注射將AAV9-FGF23及AAV9-GFP載體注入小鼠體內，熒光顯微鏡及WB檢測顯示AAV9病毒高效傳遞至小鼠心臟，FGF23蛋白在心臟組織中成功過表達（圖6）。FGF23在心(xin)臟(zang)組織(zhi)中的過表達加重了(le)Ang II誘導的心(xin)功(gong)能障(zhang)礙，并損(sun)害了(le)OA對心(xin)臟(zang)重構及心(xin)肌纖維化的保(bao)護作用。

圖5. 過表達UCHL1可加速TAC術后小鼠的心肌肥厚

圖6. AAV9注射3周后小鼠心臟組織熒光結果及FGF23蛋白水平檢測

維真客戶AAV心臟注射實例 05
Redd1 protects against post?infarction cardiac dysfunction by targeting apoptosis and autophagy

心(xin)(xin)肌梗(geng)死（MI）是全球發(fa)(fa)病率和死亡率最(zui)高的(de)心(xin)(xin)臟(zang)疾病之一(yi)，梗(geng)死后會發(fa)(fa)生心(xin)(xin)肌重(zhong)塑(su)并(bing)可能(neng)導致心(xin)(xin)力衰竭(jie)。目(mu)前，藥物干預仍是預防(fang)梗(geng)死后心(xin)(xin)臟(zang)重(zhong)塑(su)和功能(neng)障礙的(de)有效治療(liao)方法，因此，尋找有效的(de)干預靶點，減輕心(xin)(xin)肌梗(geng)死后心(xin)(xin)臟(zang)重(zhong)構(gou)，從而防(fang)止梗(geng)死后患者心(xin)(xin)力衰竭(jie)的(de)發(fa)(fa)展是至關重(zhong)要的(de)。據(ju)報道，細胞凋亡和自噬(shi)(shi)參(can)與心(xin)(xin)肌組織發(fa)(fa)生的(de)生理過程，而且哺乳(ru)動物雷帕霉素(su)靶蛋白(mTOR)被(bei)證實(shi)在許多心(xin)(xin)臟(zang)病中(zhong)可同時調(diao)節凋亡和自噬(shi)(shi)相(xiang)關的(de)發(fa)(fa)病機制(zhi)，但(dan)其(qi)具體調(diao)控機制(zhi)尚不清楚。發(fa)(fa)育(yu)及(ji)DNA損(sun)傷反應調(diao)節基因1（Redd1）參(can)與mTOR活性調(diao)節，但(dan)其(qi)在心(xin)(xin)臟(zang)中(zhong)的(de)作(zuo)用知之甚少。

在本(ben)研(yan)究(jiu)(jiu)中，作者首先檢測(ce)了(le)MI小(xiao)鼠心(xin)臟中Redd1的(de)(de)表(biao)達情(qing)況，發(fa)現(xian)Redd1表(biao)達量下調。進(jin)一(yi)步使用(yong)AAV9介導Redd1過表(biao)達發(fa)現(xian)Redd1的(de)(de)過表(biao)達改善了(le)小(xiao)鼠左心(xin)室(shi)功能障礙，降(jiang)低了(le)擴張指數(shu)，并抑制了(le)心(xin)肌(ji)細(xi)胞凋(diao)亡(wang)及(ji)改善了(le)自噬。此外，研(yan)究(jiu)(jiu)發(fa)現(xian)過表(biao)達Redd1可以抑制mTOR及(ji)其(qi)下游效應(ying)蛋白的(de)(de)磷酸化，進(jin)而緩(huan)解缺血(xue)損(sun)傷引起(qi)的(de)(de)心(xin)室(shi)功能障礙。綜上所述，本(ben)研(yan)究(jiu)(jiu)證明(ming)Redd1過表(biao)達通過mTOR信號(hao)通路減少細(xi)胞凋(diao)亡(wang)和增強自噬來保護心(xin)肌(ji)梗(geng)死后(hou)心(xin)力衰(shuai)竭的(de)(de)發(fa)生和持續，深(shen)入揭示(shi)了(le)Redd1是心(xin)肌(ji)梗(geng)死后(hou)心(xin)力衰(shuai)竭發(fa)展的(de)(de)治療靶點(dian)。

研究人員通過尾靜脈注射AAV9載體上調Redd1的表達，發現小鼠心肌細胞中Redd1表達量顯著上升。Redd1的過表達顯著降(jiang)低(di)了LVEDd和(he)LVESd，大(da)大(da)提高了LVEF 和(he)LVFS水平(ping)，并使(shi)ANP和(he)BNP mRNA水平(ping)大(da)幅下降(jiang)，同(tong)時β-MHC mRNA水平(ping)也略(lve)有下降(jiang)。總的來說，Redd1過表達在心(xin)肌梗死后對心(xin)功能障礙和(he)心(xin)臟擴張有保(bao)護作用。

圖7. Redd1過表達可預防心肌梗死后心功能不全

維真客戶AAV心臟注射實例 06
Downregulation of miR-146a Contributes to Cardiac Dysfunction Induced by the Tyrosine Kinase Inhibitor Sunitinib

舒(shu)尼(ni)替尼(ni)（SNT）等酪氨(an)酸激(ji)酶(mei)抑(yi)制劑可以顯著提高(gao)癌癥患者(zhe)(zhe)的(de)預(yu)期壽命，但是(shi)這些(xie)藥物的(de)使(shi)用(yong)可能會(hui)引發心(xin)(xin)(xin)臟(zang)收縮功能障礙、高(gao)血(xue)壓、慢性心(xin)(xin)(xin)力衰竭(jie)等心(xin)(xin)(xin)血(xue)管(guan)方面的(de)不良反應。然(ran)而，這種作用(yong)的(de)分子(zi)機(ji)制仍然(ran)不清(qing)楚。MicroRNA是(shi)心(xin)(xin)(xin)血(xue)管(guan)疾病(bing)和酪氨(an)酸激(ji)酶(mei)途徑(jing)中的(de)關(guan)鍵調(diao)控因子(zi)，已被證實在(zai)心(xin)(xin)(xin)血(xue)管(guan)疾病(bing)中發揮(hui)著關(guan)鍵作用(yong)。MicroRNA的(de)過表(biao)達和下調(diao)可能是(shi)治療心(xin)(xin)(xin)臟(zang)病(bing)患者(zhe)(zhe)的(de)一種有效方法。

研究人員使用miRNA芯片分(fen)析了舒尼替(ti)尼處理后小鼠心肌中miRNA的(de)(de)(de)差異(yi)表(biao)達(da)，發(fa)現miR-146a顯著(zhu)下(xia)調。利(li)用熒(ying)光素酶報告基因檢(jian)測(ce)實(shi)驗(yan)證(zheng)實(shi)miR-146a的(de)(de)(de)下(xia)游靶點為Pln和Ank2，二者與心臟收縮(suo)功(gong)能障(zhang)礙密切相(xiang)關。體(ti)內外實(shi)驗(yan)結果表(biao)明SNT下(xia)調miR-146a的(de)(de)(de)表(biao)達(da)，并通過調控下(xia)游靶點PLN和ANK2導致心臟收縮(suo)功(gong)能障(zhang)礙，上調miR-146a可(ke)緩解SNT對心臟收縮(suo)力的(de)(de)(de)抑制(zhi)作用。本研究揭示了miR-146a可(ke)能是一種(zhong)有效的(de)(de)(de)SNT誘導的(de)(de)(de)心臟功(gong)能障(zhang)礙的(de)(de)(de)保護劑。

如圖8所示，研究人員使用心臟特異性啟動子cTNT驅動的AAV9載體在小鼠心臟特異表達miR-146a，不同組織的熒光圖像表明，靜脈注射病毒載體后僅心臟被高效感染。通過超聲心動圖(tu)檢測心臟收(shou)縮功(gong)能(neng)(neng)，結果表明心臟中miR-146a的過表達(da)顯著抑制了SNT誘導的EF和FS降低，表明心臟功(gong)能(neng)(neng)得到改(gai)善(shan)。

圖8. 體內過表達miR-146a可減輕SNT誘導的心肌收縮功能障礙