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『糖尿病治療新靶點』南京大學韓曉教授團隊發現HRD1——T2D治療新靶點！

背景介紹

糖尿病（diabetes）是一種以葡萄糖和脂肪代謝紊亂、血漿葡萄糖水平升高為主要臨床特點的代謝性疾病，長期的高血糖，導致各種組織，特別是眼、腎、心臟、血管、神經的慢性損害、功能障礙。糖尿病主要分為四類：1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠期糖尿病和特殊類型糖尿病，以2型糖尿病（type 2 diabetes, T2D）最為常見。1型(xing)或2型(xing)糖尿(niao)病(bing)均存在明顯(xian)的遺(yi)傳異質性。1型(xing)糖尿(niao)病(bing)有多(duo)個DNA位點參與發病(bing)，其中(zhong)以HLA抗原(yuan)基(ji)因(yin)中(zhong)DQ位點多(duo)態性關(guan)系最為密切。2型(xing)糖尿(niao)病(bing)已發現多(duo)種明確的基(ji)因(yin)突(tu)變，如胰(yi)島(dao)(dao)素基(ji)因(yin)、胰(yi)島(dao)(dao)素受體基(ji)因(yin)、葡萄(tao)糖激酶基(ji)因(yin)、線粒體基(ji)因(yin)等。

2020年，南京醫科大學韓曉教授研究團隊在《Diabetes 》上發表的“HRD1 an important player in pancreatic β-cell failure and therapeutic target for type 2 diabetic mice”論文研究表明胰島β細胞中HRD1的特異性過表達引發胰島素分泌受損，最終導致嚴重高血糖。該研究成果發現HRD1可作為2型糖尿病的治療靶點，使人類在治療T2D方面又取得新進展！

HRD1 (HMG-CoA reductase degradation 1)，是內質網應激相關(guan)E3泛素連接酶的(de)(de)代表，通(tong)過靶向并有效降解錯誤折疊的(de)(de)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)素原維持(chi)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)β細胞的(de)(de)功能，HRD1的(de)(de)缺失會導致胰(yi)(yi)島(dao)(dao)素分泌（GSIS）受(shou)損(sun)。研究報道HRD1在(zai) Akita糖尿病小鼠胰(yi)(yi)島(dao)(dao)中表達上調。NCBI GEO數據庫(ku)的(de)(de)基(ji)因組數據顯示，T2D患者胰(yi)(yi)島(dao)(dao)細胞HRD1 mRNA水平升高。然(ran)而，HRD1在(zai)胰(yi)(yi)島(dao)(dao)β細胞中的(de)(de)特異性病理(li)作用仍不明(ming)確(que)。

研究結果分享

1.糖尿病人及小鼠胰腺β細胞HRD1表達升高

通過Western blot、qRT-PCR和免疫熒光染色方法，作者(zhe)發現：① db/db和HFD飼料喂養的(de)糖尿病(bing)(bing)小(xiao)鼠胰(yi)(yi)島中HRD1顯著上調；② T2D患者(zhe)分離(li)的(de)胰(yi)(yi)島也得(de)到了(le)類似的(de)結果；③db/db和HFD飼喂的(de)小(xiao)鼠胰(yi)(yi)腺(xian)β細(xi)(xi)胞(bao)(bao)內質網(wang)HRD1顯著升高(gao)(gao)，伴隨胰(yi)(yi)島素水平的(de)顯著降低(di)；④ 長(chang)期暴露(lu)于高(gao)(gao)糖環境的(de)人(ren)及(ji)小(xiao)鼠胰(yi)(yi)島細(xi)(xi)胞(bao)(bao)HRD1表(biao)達較(jiao)正(zheng)常組(zu)明(ming)顯上調；⑤ 在(zai)慢性高(gao)(gao)糖處理的(de)人(ren)胰(yi)(yi)島初(chu)級β細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中HRD1表(biao)達增(zeng)強。綜上所(suo)述，糖尿病(bing)(bing)人(ren)及(ji)小(xiao)鼠胰(yi)(yi)腺(xian)β細(xi)(xi)胞(bao)(bao)HRD1表(biao)達水平升高(gao)(gao)，可能與β細(xi)(xi)胞(bao)(bao)的(de)衰竭和糖尿病(bing)(bing)的(de)發生有(you)關。

圖1. HRD1在糖尿病人及小鼠胰島β細胞中表達升高

2. 抑制HRD1改善糖尿病小鼠的血糖控制和血糖反應

作者將AAV-MIP-shHRD1-GFP（維真生物提供）注射入雄性C57BL / 6J小鼠胰腺導管，特異性敲低小鼠β細胞中的HRD1。免疫熒光觀察顯示AAV病毒在體內有效傳遞。

隨后作者將AAV8-MIP-shHRD1（維真生物提供）注射入HFD飼喂(wei)的糖(tang)(tang)尿病(bing)小(xiao)(xiao)鼠胰(yi)腺導管，2周后，糖(tang)(tang)尿病(bing)小(xiao)(xiao)鼠空(kong)腹血糖(tang)(tang)明(ming)顯(xian)下降(jiang)。4周后，糖(tang)(tang)耐量試驗（Intraperitoneal Glucose Tolerance Test，IPGTT）結果(guo)顯(xian)示糖(tang)(tang)尿病(bing)小(xiao)(xiao)鼠血糖(tang)(tang)反應(ying)和(he)血清胰(yi)島(dao)素(su)水平明(ming)顯(xian)改善(shan)。AAV-shHRD1注射db/db小(xiao)(xiao)鼠的葡萄糖(tang)(tang)反應(ying)也有改善(shan)。綜上(shang)結果(guo)表明(ming)HRD1在胰(yi)島(dao)β細胞功(gong)能障礙(ai)和(he)糖(tang)(tang)尿病(bing)中發揮重要作用(yong)。

圖2. 抑制HRD1可改善糖尿病小鼠高血糖和葡萄糖耐受不良

3. HRD1過表達致胰島素分泌受損和血糖升高

作者胰腺導管內注射AAV8-MIP-HRD1（維真生物提供），注射(she)后胰(yi)島HRD1蛋(dan)白(bai)水平(ping)(ping)明(ming)顯升高(gao)，小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)的空腹(fu)血(xue)(xue)糖(tang)和(he)復餐血(xue)(xue)糖(tang)水平(ping)(ping)顯著升高(gao)，獲得β細(xi)胞(bao)HRD1特(te)異(yi)性過表(biao)達(da)小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)。IPGTT結果顯示糖(tang)代謝嚴(yan)重受損(sun)，HRD1特(te)異(yi)性過表(biao)達(da)的小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)血(xue)(xue)漿(jiang)胰(yi)島素水平(ping)(ping)表(biao)現紊(wen)亂。上述結果表(biao)明(ming)β細(xi)胞(bao)HRD1上調可誘(you)發(fa)高(gao)血(xue)(xue)糖(tang)并損(sun)傷胰(yi)島素的分泌(mi)。

圖3. HRD1過表達引發高血糖和葡萄糖耐受不良

4. HRD1和MafA在細胞中的表達水平呈負相關

為了確定HRD1高(gao)表達(da)引起(qi)的(de)(de)β細(xi)(xi)胞胰島素分泌(mi)受損的(de)(de)分子(zi)基礎，作者通過質譜分析研究Ad-HRD1 或 Ad-GFP感(gan)染后MIN6細(xi)(xi)胞HRD1的(de)(de)結(jie)合蛋白(bai)，發現其(qi)中(zhong)一(yi)種(zhong)蛋白(bai)細(xi)(xi)胞特異性轉錄因(yin)子(zi)MafA與碳水化合物刺激反(fan)應有關，免疫沉淀分析證實HRD1和(he)MafA共存于沉淀復合物中(zhong)，當HRD1高(gao)表達(da)時，HRD1和(he)MafA的(de)(de)相互(hu)作用增強，在(zai)人胰島證實HRD1和(he)MafA之(zhi)間(jian)呈負相關。MafA是β細(xi)(xi)胞功能和(he)健康的(de)(de)積(ji)極指標，HRD1過表達(da)在(zai)翻譯水平而非(fei)轉錄水平上(shang)顯著(zhu)降低(di)了MafA的(de)(de)表達(da)。

圖4. HRD1和MafA直接相互作用，在細胞中表達水平呈負相關

免(mian)疫沉(chen)淀(dian)分(fen)析證實HRD1和MafA同時存在(zai)于沉(chen)淀(dian)復(fu)合物(wu)中，HRD1和MafA之間呈負相(xiang)關作用(yong)，當(dang)HRD1高表達(da)時，二(er)者(zhe)的(de)相(xiang)互作用(yong)增強。此外，HRD1過表達(da)在(zai)翻譯水(shui)平而非轉錄水(shui)平上(shang)顯著降低(di)了MafA的(de)表達(da)。

5. HRD1通過抑制MafA表達致胰島素分泌受損

作者(zhe)研(yan)究發(fa)現單獨感染(ran)Ad-HRD1的(de)小鼠(shu)胰(yi)島(dao)和(he)(he)MIN6細胞(bao)，胰(yi)島(dao)素(su)分泌明(ming)顯被抑(yi)制，這種(zhong)抑(yi)制可通(tong)過補充MafA得以恢復(fu)(fu)。敲(qiao)除HRD1可有(you)效減輕(qing)因暴露于慢性高(gao)糖環境而導致的(de)小鼠(shu)胰(yi)島(dao)和(he)(he)MIN6細胞(bao)MafA的(de)減少。小鼠(shu)胰(yi)島(dao)細胞(bao)和(he)(he)長期(qi)暴露高(gao)糖環境的(de)MIN6細胞(bao)HRD1敲(qiao)除后(hou)，葡萄糖或(huo)KCL刺激的(de)胰(yi)島(dao)素(su)分泌也(ye)(ye)得到了恢復(fu)(fu)。HFD飼喂的(de)小鼠(shu)和(he)(he)db/db小鼠(shu)，AAV-shHRD1注射4周后(hou)，胰(yi)島(dao)MafA表(biao)達(da)(da)水平也(ye)(ye)出(chu)現反(fan)彈。綜(zong)上所述，HRD1高(gao)表(biao)達(da)(da)通(tong)過下調MafA使β細胞(bao)發(fa)生功能障(zhang)礙。

圖5. HRD1高表達通過下調MafA導致胰島素分泌受損

6. HRD1導致MafA在細胞質積累，并削弱其核轉錄調節活性

在(zai)HRD1過(guo)(guo)表(biao)(biao)達時，在(zai)MIN6細(xi)胞(bao)(bao)及HEK293A細(xi)胞(bao)(bao)，MafA和(he)HRD1定位(wei)于(yu)細(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)周圍而不是細(xi)胞(bao)(bao)核(he)(he)，主要在(zai)ER區域共定位(wei)，表(biao)(biao)明(ming)HRD1在(zai)ER附近捕捉MafA，通過(guo)(guo)其胞(bao)(bao)質C端結(jie)構域與(yu)胞(bao)(bao)質MafA相互作(zuo)用(yong)。熒光(guang)素(su)酶報告基因檢(jian)測(ce)，作(zuo)者發現(xian)HRD1過(guo)(guo)表(biao)(biao)達顯著(zhu)降(jiang)低MafA的(de)核(he)(he)轉錄調(diao)控(kong)活(huo)性(xing)，qPCR和(he)ChIP-qPCR結(jie)果證實胰島(dao)素(su)是MafA調(diao)控(kong)的(de)主要基因。HRD1的(de)敲低部分(fen)挽救了糖脂毒性(xing)條件下核(he)(he)MafA的(de)減少，表(biao)(biao)明(ming)HRD1的(de)降(jiang)低足以維持核(he)(he)MafA水(shui)平(ping)。HRD1不僅調(diao)節細(xi)胞(bao)(bao)內MafA的(de)數量，而且調(diao)節其在(zai)β細(xi)胞(bao)(bao)中的(de)定位(wei)。

圖6. HRD1誘導MafA細胞質聚集，削弱其在細胞核中的功能

7. HRD1作為E3泛素連接酶降解MafA

HRD1泛(fan)素(su)(su)連接酶的(de)(de)(de)活性(xing)離不開其Ring環域內的(de)(de)(de)第(di)291位(wei)半胱(guang)氨酸(suan)，作者測量了(le)HRD1- WT及(ji)C291S突變體HRD1 (HRD1- C291S)對(dui)MafA泛(fan)素(su)(su)化(hua)(hua)的(de)(de)(de)影響，發(fa)現HRD1- WT過表達顯(xian)著增加MafA泛(fan)素(su)(su)化(hua)(hua)；HRD1下(xia)調可顯(xian)著降低慢性(xing)高糖處理MIN6細胞MafA的(de)(de)(de)泛(fan)素(su)(su)化(hua)(hua)，HRD1的(de)(de)(de)缺失抑制高糖環境下(xia)MafA蛋(dan)(dan)白的(de)(de)(de)快速(su)降解(jie)，并恢復MIN6細胞總MafA蛋(dan)(dan)白的(de)(de)(de)下(xia)降。上述結(jie)果表明(ming)HRD1是E3泛(fan)素(su)(su)連接酶，其作用(yong)是負責MafA的(de)(de)(de)泛(fan)素(su)(su)化(hua)(hua)和降解(jie)。

圖7. HRD1靶向MafA進行泛素化并將其降解

小結

本研(yan)究揭示HRD1作為(wei)E3泛(fan)素連(lian)接(jie)酶介(jie)導MafA的泛(fan)素化和降解，它(ta)的失調(diao)(缺失或過量)可導致(zhi)胰島β細(xi)胞功能(neng)(neng)衰竭(jie)，在糖(tang)尿(niao)病(bing)的發病(bing)機(ji)理(li)中起著重要的作用。針對(dui)HRD1靶向治療(liao)可提高MafA的蛋(dan)白水(shui)平，改善β細(xi)胞功能(neng)(neng)，治療(liao)2型糖(tang)尿(niao)病(bing)。

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參考文獻

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