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Tripartite motif 16 ameliorates nonalcoholic steatohepatitis by promoting the degradation of phospho-TAK1

非酒精性脂肪性肝炎(NASH)相關的肝細胞癌和肝病已成為發達國家需要肝移植的主要原因。脂質過度積累導致的脂毒性能夠引起內質網應激和破壞蛋白質穩態，在NASH中發揮核心作用。目前還沒有批準任何藥物療法用于治療NASH，因此探究NASH的發展機制，尋找潛在的治療靶點至關重要。

在本研究中，為了確定減輕脂毒性有害后果的關鍵分子，作者進行了綜合多組學分析，確定了E3連接酶TRIM16為候選分子，進一步分析發現TRIM16在脂毒性反應中顯著上調，并且過表達TRIM16（AAV8腹腔注射）減輕了(le)NASH小鼠模型的(de)(de)脂質積累和(he)肝損傷。同時(shi)，作者(zhe)還闡(chan)明了(le)TRIM16調控NASH的(de)(de)機制(zhi)，即TRIM16通(tong)過(guo)優先(xian)與磷(lin)酸化(hua)的(de)(de)TGF-β活化(hua)激(ji)(ji)酶 1 (TAK1) 相互作用(yong)并通(tong)過(guo)催(cui)化(hua)K48連(lian)接的(de)(de)泛素化(hua)促進(jin)其降解，來減弱絲裂(lie)原(yuan)活化(hua)蛋白激(ji)(ji)酶 (MAPK)信號通(tong)路的(de)(de)激(ji)(ji)活，進(jin)而(er)抑制(zhi)NASH的(de)(de)發展。總的(de)(de)來說，該研究表明TRIM16是一種(zhong)特定的(de)(de)TAK1調節器，可以在NASH中作為潛在的(de)(de)治療靶(ba)標。

圖1. TRIM16調控NASH機制

如圖2所示，AAV8-TRIM16注射后，Western blot和qPCR分析均表明TRIM16在小鼠肝臟中過表達成功。與對照組(AAV-GFP)相比，注射AAV8-TRIM16的小(xiao)鼠(shu)在經HFHC喂養(yang)16周后，肝(gan)臟重量(liang)和肝(gan)體(ti)重比明(ming)顯降低，此外，TRIM16過表達顯著減緩(huan)了HFHC喂養(yang)小(xiao)鼠(shu)肝(gan)臟中(zhong)的脂質積聚、炎癥、纖維化(hua)和肝(gan)損傷。

圖2. AAV8過表達TRIM16可減輕HFHC喂養小鼠的肝脂肪變性和炎癥

Overexpression of ring fnger protein 20 inhibits the progression of liver fbrosis via mediation of histone H2B lysine 120 ubiquitination

肝纖維化是一種慢性肝損傷，可導致肝硬化和肝癌。RNF20（環指蛋白20）又稱E3泛素蛋白連接酶BRE1A，已被報道參與慢性肝病，然而，RNF20在肝纖維化中的作用尚不清楚。研究人員先后通過肝纖維化模型的體內外研究證實，RNF20過表達可顯著抑制體內外肝纖維化的進展，表明RNF20有望成為治療肝纖維化的新靶點。

為探究RNF20在肝纖維化中的作用，研究人員建立了活體肝纖維化模型，如圖3所示，使用AAV8過表達RNF20顯著逆轉了小鼠肝組織中由CCl4引起的炎性浸潤和膠原體積，同時逆轉CCl4導致的α-SMA的表達增加和H2BK120ub蛋白水平的降低，這些結果表明，RNF20過表達可(ke)明顯減輕體內肝(gan)纖維化癥狀(zhuang)。

圖3. RNF20過表達可明顯緩解體內肝纖維化癥狀

PSMP/MSMP promotes hepatic fibrosis through CCR2 and represents a novel therapeutic target

肝(gan)(gan)(gan)纖維(wei)化是一種慢性肝(gan)(gan)(gan)損傷的(de)(de)傷口愈(yu)合反(fan)應(ying)，其特(te)征(zheng)是細胞(bao)外基質(zhi)(ECM)在(zai)肝(gan)(gan)(gan)臟(zang)過度(du)沉積，最終導致肝(gan)(gan)(gan)功能(neng)喪(sang)失和肝(gan)(gan)(gan)臟(zang)結構破(po)壞。研究表明，趨(qu)化因(yin)子(zi)受(shou)體系(xi)統(tong)在(zai)肝(gan)(gan)(gan)臟(zang)疾病的(de)(de)發(fa)病機制中起著關鍵作(zuo)用，C-C基序趨(qu)化因(yin)子(zi)受(shou)體2(CCR2)被認(ren)為是治療肝(gan)(gan)(gan)纖維(wei)化很有前景的(de)(de)一個靶點(dian)。PC3分(fen)泌微蛋白(PSMP)/微精原蛋白(MSMP)是一種新(xin)型的(de)(de)趨(qu)化細胞(bao)因(yin)子(zi)，作(zuo)為CCR2配(pei)體可以募集外周血單(dan)核細胞(bao)和淋巴(ba)細胞(bao)，可能(neng)影響(xiang)炎癥(zheng)(zheng)和癌(ai)癥(zheng)(zheng)的(de)(de)發(fa)展(zhan)。

首先，研究者通過免疫組織化學檢測了不同肝臟疾病組織中的PSMP水平，發現PSMP在肝纖維化患者肝組織中表達較高。接著，構建了PSMP敲除小鼠（PSMP^-/-小鼠）,發現PSMP^-/-小鼠血清丙氨酸轉氨酶(ALT)水平明顯降低，肝損傷得到改善。利用AAV8載體在PSMP^-/-小鼠過表達hPSMP，發現肝損傷和纖維化顯著加重；并通過構建PSMP和CCR2雙敲除小鼠模型發現PSMP過表達以CCR2依賴的方式促進肝纖維化的發展。作者揭示了PSMP通過促進炎癥巨噬細胞浸潤、M1極化、促炎細胞因子產生以及通過CCR2直接激活肝星狀細胞進而加速肝纖維化，提出PSMP可能是一個潛在的肝纖維化治療靶點，其抗體可能是治療肝纖維化的潛在藥物。

圖4. PSMP/MSMP通過CCR2促進肝纖維化

通過尾靜脈注射AAV8-hPSMP后，PSMP^-/-小鼠肝臟PSMP表達量顯著升高，注射4周后PSMP依舊有較高的表達。接著再用CCl₄處理以誘(you)導肝(gan)(gan)纖維(wei)化，發(fa)(fa)現(xian)PSMP過表(biao)達引起的肝(gan)(gan)損傷和(he)纖維(wei)化顯著加重，并通過構建PSMP和(he)CCR2雙(shuang)敲(qiao)除小鼠模型發(fa)(fa)現(xian)PSMP過表(biao)達以CCR2依賴的方式促(cu)進肝(gan)(gan)纖維(wei)化的發(fa)(fa)展。

圖5. AAV8過表達PSMP對CCl4誘導小鼠肝纖維化的影響

Hepatic neddylation targets and stabilizes electron transfer flavoproteins to facilitate fatty acid β-oxidation

類泛(fan)素(su)化(hua)修飾（Neddylation）是一(yi)種通(tong)過將NEDD8與特(te)定底物(wu)蛋(dan)(dan)白(bai)中的(de)(de)賴氨(an)酸(suan)共價結(jie)合(he)，控制細胞的(de)(de)生(sheng)存(cun)和(he)增殖(zhi)的(de)(de)泛(fan)素(su)化(hua)樣途(tu)徑。但是，類泛(fan)素(su)化(hua)在(zai)哺乳動物(wu)代謝中的(de)(de)生(sheng)理作(zuo)用尚(shang)不(bu)明確(que)，也沒有(you)明確(que)的(de)(de)線粒體靶點。肝臟特(te)異(yi)性(xing)(xing)UBA3缺乏會導致類似戊二酸(suan)尿癥II型（GA-II）的(de)(de)系統性(xing)(xing)異(yi)常，GA-II是一(yi)種罕見的(de)(de)常染色(se)體隱性(xing)(xing)遺(yi)傳(chuan)性(xing)(xing)脂肪酸(suan)氧化(hua)障礙疾病，由(you)線粒體電(dian)子轉(zhuan)移黃素(su)蛋(dan)(dan)白(bai)（ETF:ETFA和(he)ETFB）或相應的(de)(de)泛(fan)醌氧化(hua)還原酶缺陷引起(qi)。然(ran)而ETFA和(he)ETFB蛋(dan)(dan)白(bai)水(shui)(shui)平(ping)在(zai)轉(zhuan)錄(lu)后水(shui)(shui)平(ping)調(diao)控的(de)(de)機(ji)制尚(shang)不(bu)清(qing)楚。

在本研究中，作者構建的肝臟特異性UBA3和NEDD8缺失的小鼠模型，表現出自發性脂肪肝和肝細胞衰老的新生兒死亡，并伴有肝臟脂肪酸-β氧化缺陷；成年小鼠中UBA3的特異性缺失（通過AAV-DJ進行尾靜脈注射）導(dao)(dao)致ETF蛋(dan)白(bai)的(de)減少，并(bing)增加(jia)禁食誘導(dao)(dao)的(de)脂肪變(bian)性和死(si)亡(wang)率(lv)。IB和IF分析發(fa)(fa)現新(xin)生(sheng)小鼠線粒體蛋(dan)白(bai)也發(fa)(fa)生(sheng)類泛(fan)(fan)素化(hua)，免(mian)疫共沉(chen)淀分析發(fa)(fa)現ETF蛋(dan)白(bai)為類泛(fan)(fan)素化(hua)的(de)底物。此外(wai)，ETF基因突變(bian)導(dao)(dao)致類泛(fan)(fan)素化(hua)修飾(shi)缺陷，促進(jin)了(le)GA-II的(de)發(fa)(fa)病。本研究表明類泛(fan)(fan)素化(hua)修飾(shi)是一種(zhong)可(ke)以通過阻斷肝(gan)細胞內ETFs的(de)泛(fan)(fan)素化(hua)和降解來靶向并(bing)穩定ETFs的(de)泛(fan)(fan)素化(hua)樣(yang)修飾(shi)途徑，肝(gan)類泛(fan)(fan)素化(hua)可(ke)防止新(xin)生(sheng)小鼠出現GA-II類異(yi)常，降低成年小鼠因禁食引起的(de)死(si)亡(wang)率(lv)。

如圖6A所示，研究人員將AAV-DJ-CAG-Cre通過尾靜脈注射至8周齡雄性Uba3^F/F和同窩Uba3^F/+ 小鼠體內，IB分析證實Uba3^F/F小鼠肝臟中UBA3缺失，但心臟和腎臟中沒有，證明肝臟特異性UBA3缺失小鼠模型構建成功。經AAV-DJ-Cre轉導后，Uba3^F/F小鼠和Nedd8^F/F小鼠肝(gan)臟(zang)中UBA3、Nedd8的(de)缺失導致ETFs蛋(dan)白表達水(shui)平(ping)的(de)顯(xian)著下降；對(dui)小鼠進行(xing)禁食處理，研究者發現UBA3、Nedd8的(de)缺失導致小鼠肝(gan)臟(zang)脂質儲存和死(si)亡率增(zeng)加，表明成年小鼠肝(gan)臟(zang)中的(de)類泛素(su)化(hua)/ETF軸可(ke)以預防禁食誘導的(de)脂肪變(bian)性和死(si)亡率。

圖6A. 構建肝臟特異性UBA3缺失小鼠模型

圖6B. 類泛素化/ETF軸可以預防成年小鼠肝臟中由禁食誘導的脂肪變性和死亡率

Suppression of YAP/TAZ-Notch1-NICD axis by bromodomain and extraterminal protein inhibition impairs liver regeneration

肝臟有很強的再生能力，許多肝臟疾病的治療都是通過有效的肝再生來調節的。但是，調控肝再生的生物學機制仍不清楚。研究表明，溴域和末端外結構域(BET)蛋白及其抑制劑與肝癌密切相關，此外BET蛋白在斑馬魚的肝再生過程中至關重要，但具體的機制仍需進一步探究。Hippo-YAP/TAZ通路已被證實是調節細胞增殖和器官大小的關鍵因子，在多種肝疾病中處于激活狀態，但其是否參與肝再生過程也尚不明確。

在本(ben)研究中，作者發現BET蛋(dan)白(bai)(bai)抑(yi)制(zhi)(zhi)劑JQ1顯著(zhu)抑(yi)制(zhi)(zhi)70%肝(gan)(gan)(gan)臟切除術（PH）后的(de)(de)肝(gan)(gan)(gan)再(zai)生(sheng)，并且JQ1可以(yi)抑(yi)制(zhi)(zhi)肝(gan)(gan)(gan)臟細(xi)(xi)胞(bao)的(de)(de)增殖。進一(yi)步檢(jian)測發現JQ1在mRNA和(he)蛋(dan)白(bai)(bai)水(shui)平抑(yi)制(zhi)(zhi)體內肝(gan)(gan)(gan)再(zai)生(sheng)過(guo)程YAP/YAZ和(he)Notch信號(hao)(hao)通路的(de)(de)表(biao)達(da)，而YAP/TAZ抑(yi)制(zhi)(zhi)劑顯著(zhu)下(xia)調了(le)YAP、TAZ和(he)Notch信號(hao)(hao)通路相關基因的(de)(de)表(biao)達(da)，并抑(yi)制(zhi)(zhi)70%PH后肝(gan)(gan)(gan)再(zai)生(sheng)。接著(zhu)利用AML12-Yap-shRNA細(xi)(xi)胞(bao)系(xi)證明(ming)了(le)JQ1可以(yi)通過(guo)抑(yi)制(zhi)(zhi)AML12細(xi)(xi)胞(bao)YAP的(de)(de)表(biao)達(da)，間接下(xia)調Notch信號(hao)(hao)通路的(de)(de)活性，下(xia)游(you)分子Notch1被證明(ming)是YAP/TAZ的(de)(de)功能靶標。最后發現通過(guo)過(guo)表(biao)達(da)YAP可以(yi)補救BET蛋(dan)白(bai)(bai)抑(yi)制(zhi)(zhi)劑引起的(de)(de)肝(gan)(gan)(gan)再(zai)生(sheng)損傷，揭示(shi)了(le)YAP/TAZ–Notch1–NICD在肝(gan)(gan)(gan)再(zai)生(sheng)中的(de)(de)功能以(yi)及(ji)BET蛋(dan)白(bai)(bai)抑(yi)制(zhi)(zhi)劑（如JQ1）在肝(gan)(gan)(gan)臟疾病(bing)治(zhi)療(liao)中的(de)(de)風險(xian)。

腹腔注射表達YAP的AAV9過表達載體，發現YAP顯著高表達。與YAP非過表達組相比，YAP過表達后小鼠LW/BW比、肝再生的兩個關鍵調節因子Hgf和Vegf表達水平及Notch信號通路相關蛋白（Jagged1, Notch1和NICD）表達水平均明顯升高。不僅如此，Ki-67（細胞增殖指數）陽性肝細胞數量也遠遠高于YAP非過表達組。這些數據說明，小鼠肝臟中YAP的過表達可以挽救BET蛋白抑制劑對肝再生的損傷。

圖7. AAV9過表達Yap可補救BET蛋白抑制劑引起的肝再生損傷