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『CircRNA領域新發現』浙江大學范順武教授課題組發現CircRNA :CircSERPINE2,為骨關節炎治療提供有效策略

環狀RNA（circular RNAs，CircRNAs）是一類特殊的非編碼RNA分子，不具有5' 末端帽子和3' 末端poly(A)尾巴、并以共價鍵形成環形結構，具有組織特異性和高度保守性，廣泛存在于哺乳動物細胞中。與線性RNA相比，CircRNA分子呈封閉環狀結構，不受RNA外切酶影響，表達更穩定，不易降解。一些CircRNAs富含miRNA結合位點，在細胞中可以作為miRNA海綿（miRNA sponge）或競爭性內源RNA（competing endogenous RNAs，ceRNA），自動隔離或競爭性抑制miRNA的活性，進而解除miRNA對其靶基因的抑制作用，提高靶基因的表達水平。最近不斷發現circRNA在不同研究領域和研究方向的新功能，circRNA已成為RNA研究領域的最新熱點，吸引著無數科研工作者的目光。

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種由增齡、肥胖、勞損、創傷等諸多因素引起的退行性病變，主要特征是軟骨退化損傷、關節邊緣和軟骨下骨反應性增生，臨床表現為緩慢發展的關節疼痛、壓痛、僵硬、活動受限和關節畸形等，多發于中老年人。科學家研究發現CircRNA表達水平的改變與OA發生有關，浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院范順武教授帶領的團隊在對OA研究中發現了一種新的CircRNA，（hsa_circ_0008365，命名為CircSERPINE2），CircSERPINE2過表達通過miR-1271 - ERG通路緩解軟骨細胞（HCs）凋亡及促進胞外基質（ECM）的合成代謝，在OA治療中可發揮積極作用。

研究結果

1.CircRNA在正常人體及OA患者組織中的表達

 臨床OA患者和正常人體組織進行RNAseq分析，發現OA組CircRNA表達呈現差異。RT-qPCR分析確定了25個表達差異最大的CircRNA及14個下調的CircRNA。作者用白細胞介素(IL)-1β和腫瘤壞死因子(TNF)-α處理的的原發性人類軟骨細胞(HCs)試驗證實了包含hsa_circ_0008365在內的六種CircRNA在OA樣本組織中表達下調。Sanger測序法確定hsa_circ_0008365是由Serpine2基因的第二個至第四個外顯子環化組成，即5’端剪接位點和外顯子3’端相應位點形成的頭尾剪接，因此命名為CircSERPINE2。

 OA患者和正常人體軟骨細胞中CircSERPINE2的表達水平檢測顯示，CircSERPINE2在OA樣本呈表達下調模式，在HCs的細胞質中大量表達（圖1）。

圖1 CircSERPINE2在OA軟骨組織和細胞中的驗證和表達

2.CircSERPINE2調節軟骨細胞的凋亡和ECM代謝

 為了評估CircSERPINE2參與了基質降解酶的調控，作者用CircSERPINE2小干擾RNA轉染HCs，發現CircSERPINE2表達下調并不影響SERPINE2的mRNA水平，而是增加HCs的凋亡率，CircSERPINE2的過表達可明顯抑制IL-1β誘導的HCs凋亡率。WB結果顯示抑制CircSERPINE2的表達增加了MMP3、MMP13和ADAMTS4（基質降解相關酶）的表達，降低SOX9、COL2A1和aggrecan的表達。IF和RT-qPCR結果再次證實，CircSERPINE2表達的下調顯著影響了HCs和SW1353細胞（人骨肉瘤細胞）中MMP13、ADAMTS4、COL2A1和aggrecan的表達水平，CircSERPINE2的下調促進了HCs和SW1353細胞凋亡和代謝過程（圖2）。

圖2 CircSERPINE2表達下調誘導軟骨細胞基質降解酶的表達

3.CircSERPINE2是miRNAs的吸附海綿

 研究發現OA組織中有191個miRNA表達上調，CircSERPINE2可下調miR-1271和miR-93的表達。WB結果顯示miR-1271與基質降解和合成蛋白的表達有關，而miR-1271在10個OA樣本軟骨中表達上調。熒光素酶檢測和FISH實驗證實CircSERPINE2與miR-1271結合。miR-1271過表達的細胞凋亡率升高，伴隨MMP3、MMP13和ADAMTS4表達的增強，SOX9、COL2A1和aggrecan表達的降低。抑制miR-1271的表達時，基質降解和合成相關蛋白的表達水平則與此相反（圖3）。

圖3 CircSERPINE2作為miR-1271的海綿在HC細胞發揮作用

4.CircSERPINE2通過靶向miR-1271的表達在OA中發揮作用

 將sh-CircSERPINE2和miR-1271海綿腺病毒共感染細胞。已知下調CircSERPINE2的表達可增加HC的凋亡率，而抑制miR-1271和CircSERPINE2的表達可顯著挽救HC的凋亡率。與單獨感染sh-CircSERPINE2和miR-1271海綿腺病毒的細胞相比，共感染sh-CircSERPINE2和miR-1271海綿腺病毒的細胞中，MMP13、MMP3和ADAMTS4的蛋白和mRNA水平顯著降低，SOX9、COL2A1和aggrecan的蛋白和mRNA水平則顯著提高。IF結果顯示與用CircSERPINE2抑制劑處理過的細胞相比，CircSERPINE2和miR-1271表達抑制劑處理的細胞中，COL2A1和aggrecan表達水平升高，而MMP13和ADAMTS4表達水平降低，表明CircSERPINE2在體外通過靶向miR-1271發揮作用（圖4）。

圖4 miR-1271表達下調逆轉HC細胞CircSERPINE2誘導的軟骨降解

5.miR-1271直接作用于ETS相關基因

 miR-1271和CircSERPINE2作用靶點研究發現E26轉化特異性相關基因（ERG）對COL2A1、aggrecan、MMP3和MMP13表達水平的影響最為明顯，在OA受損軟骨區域顯著下調。ERG是miR-1271的一個預測靶標，熒光素酶檢測結果顯示，miR-1271 mimic明顯抑制轉染WT ERG 3 ' -UTR細胞的熒光素酶活性，降低ERG的蛋白和mRNA表達水平，而miR-1271 inhibitor則顯示出相反的作用。ERG過表達降低MMP3、MMP13和ADAMTS4的表達，提高SOX9和COL2A1的表達，表明miR-1271確實靶向ERG，內源性ERG表達與OA發病機制密切相關。

 Pre-miR-1271腺病毒感染抑制ERG的表達，明顯降低HCs中COL2A1、SOX9和aggrecan的表達，增加MMP3、MMP13和ADAMTS4的表達，ERG過表達后這些作用被消除。表明miR-1271過表達通過調節ERG損害軟骨表型（圖5）。

圖5 ERG是miR-1271的直接靶點，介導miR-1271在HC細胞中的功能

6.注射CircSERPINE2可緩解OA兔的癥狀

為了確定CircSERPINE2是否在體內OA的進展中發揮作用，作者將WT或MUT腺相關病毒(AAV) CircSERPINE2（由維真生物構建和包裝）通過關節內注射入前交叉韌帶橫切(ACLT)誘導的OA兔體內。結果顯示OA兔在注射WT AAV CircSERPINE2后軟骨表面得到了改善，而注射MUT AAV CircSERPINE2則無改善。國際骨關節炎研究協會(OARSI)評分顯示，WT AAV CircSERPINE2顯著降低了OARSI評分，而MUT AAV CircSERPINE2則提高了OARSI評分。顯微CT圖像顯示OA兔骨贅增加，而關節內注射CircSERPINE2的OA兔骨贅減少。免疫組化和WB結果顯示，注射WT AAV CircSERPINE2減輕兔OA模型軟骨基質的退行性變化，如細胞凋亡增強和分解代謝反應增強，ECM組成增加。綜上所述，CircSERPINE2的升高在抑制ECM分解代謝、促進合成代謝和減輕體內OA方面具有積極作用（圖6）。

圖6 CircSERPINE2減輕OA兔癥狀

小結

 本研究發現circRNA：CircSERPINE2 通過SERPINE2基因第2個至第4個外顯子反向拼接產生，其序列在人與兔之間較為保守，是一個參與OA的關鍵下調circRNA；CircSERPINE2含有保守的miR-1271靶點，miR-1271在OA中的表達顯著上調，且與SOX9、aggrecan和COL2A1的表達呈負相關， CircSERPINE2通過靶向miR-1271-ERG途徑抑制HCs凋亡，促進ECM合成并抑制ECM分解代謝，發揮抗OA作用。CircSERPINE2-miR-1271-ERG軸將成為預防和治療OA的新靶點。