『干貨篇』AAV在肺部應用中的靶向策略
重組腺相關病毒(rAAV)作為(wei)一(yi)(yi)種靶向性高和(he)安全性好的病毒載(zai)體(ti)，被廣泛(fan)用于基因的傳遞和(he)表達，也被認定為(wei)未(wei)來非常有前景的基因治療載(zai)體(ti)。早在上世紀90年代科學家(jia)就選擇(ze)肺作為(wei)靶向實驗器官，利用rAAV進(jin)行肺部疾(ji)病的臨床研究(jiu)。眾所(suo)周知，rAAV的轉導效率與AAV血清型(xing)及給藥途徑等因素息息相關，今(jin)天小V就帶大家(jia)一(yi)(yi)起(qi)學習一(yi)(yi)下在肺部應用中有關AAV血清型(xing)、啟動子及給藥途徑的選擇(ze)策略。
一(yi)、AAV血清型的選擇
目前研(yan)究人員已發(fa)現(xian)12種(zhong)人類(lei)AAV血清(qing)型(xing)(xing)（AAV1至(zhi)AAV12）和(he)100多種(zhong)非人類(lei)靈長(chang)動物AAV血清(qing)型(xing)(xing)。其(qi)中，多種(zhong)AAV血清(qing)型(xing)(xing)可不(bu)同程度地(di)誘(you)導目的基因在肺部的表達，比如(ru)AAV2、AAV5、AAV6及AAV9等。其中，AAV6由于可以有效地(di)介(jie)導基因(yin)在氣道和(he)肺(fei)(fei)泡(pao)II型細(xi)胞的表達，而氣道和(he)肺(fei)(fei)泡(pao)II型細(xi)胞通常是肺(fei)(fei)部(bu)疾(ji)病(bing)基因(yin)治(zhi)療的靶(ba)細(xi)胞群體，因(yin)此被認為(wei)是用于肺(fei)(fei)部(bu)基因(yin)轉移的一種理想AAV血清(qing)型。
下圖所(suo)列為AAV2、AAV5、AAV6及AAV9四種(zhong)血清型對肺部的感染情(qing)況：
研(yan)究(jiu)表(biao)明，針(zhen)對肺部(bu)感(gan)染rAAV在(zai)血清型(xing)上(shang)的(de)(de)選擇(ze)根據動物模型(xing)的(de)(de)不(bu)同而存在(zai)差異，主要體現在(zai)小(xiao)鼠及較低(di)等(deng)(deng)靈(ling)長類(lei)(lei)動物與高等(deng)(deng)靈(ling)長類(lei)(lei)動物之間。在(zai)小(xiao)鼠及一些較低(di)等(deng)(deng)的(de)(de)靈(ling)長類(lei)(lei)動物中，AAV5及AAV6是感(gan)染肺部(bu)的(de)(de)理想(xiang)選擇(ze)；針(zhen)對高等(deng)(deng)靈(ling)長類(lei)(lei)動物，AAV1對肺部(bu)的(de)(de)感(gan)染效率(lv)更高；在(zai)肺癌的(de)(de)研(yan)究(jiu)中，我(wo)們通常(chang)推(tui)薦AAV2血清型(xing)。
種類
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AAV血清型推薦
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小鼠與低等靈長類動物肺部
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AAV5/AAV6
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高等靈長類(lei)動物肺部
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AAV1
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肺(fei)癌
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AAV2
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2020年牛津大學Helena Meyer-Berg等研(yan)究者通過建立肺(fei)芽(ya)樣器官( lung bud organoids，LBOs)模(mo)型——一種由人(ren)胚胎干細胞(hESCs)生成的(de)人(ren)肺(fei)實質模(mo)型，用于(yu)篩選病(bing)毒(du)載(zai)體轉(zhuan)導，進而確(que)定適合于(yu)人(ren)肺(fei)實質轉(zhuan)導的(de)血清(qing)型。研(yan)究證(zheng)實在(zai)所用的(de)八種AAV血清(qing)型中，rAAV2和rAAV6以及rAAV6變體（rAAV6.2和rAAV6.2FF），對人(ren)肺(fei)實質親(qin)和性(xing)較強。
不同AAV血清型(xing)對人肺實質的轉導效率比較
（Meyer-Berg, H., et al. Stem Cell Res Ther, 2020.）
二、啟動子的選擇
根(gen)據不同的(de)注射方(fang)式和實驗目的(de)，可選擇(ze)不同的(de)啟動子以提高AAV在肺(fei)部的(de)表達效率。如下圖(tu)所(suo)示，CMV在啟(qi)動真(zhen)核基因表達方面(mian)具有極高(gao)(gao)的效率(lv)，可高(gao)(gao)效感染(ran)小鼠(shu)肺(fei)部；CAG同樣具有出色(se)的(de)感染氣道的(de)能(neng)力。此外，如果要感染肺臟中(zhong)特(te)定類(lei)型的(de)細(xi)胞(bao)，還可以考慮(lv)選擇細(xi)胞(bao)特(te)異性的(de)啟動子(zi)，如內皮細(xi)胞(bao)啟動子(zi)ICAM2或者(zhe)平滑(hua)肌細(xi)胞(bao)啟(qi)動子SM22α，可實現對內皮細胞(bao)或平(ping)滑肌細胞(bao)的特異性感染。
三、常用的肺部注射方式
AAV感染(ran)肺(fei)部(bu)的(de)(de)方法有(you)多種，較為(wei)常用的(de)(de)方法有(you)鼻內滴注(zhu)(zhu)法、氣管插(cha)管術、氣管內注(zhu)(zhu)射，如果對肺(fei)部(bu)感染(ran)AAV的(de)(de)特異性(xing)要求較低(di)，也可采用靜脈注(zhu)(zhu)射、腹(fu)腔注(zhu)(zhu)射等方法，當進行肺(fei)癌成瘤(liu)實驗(yan)時(shi)，也可采用瘤(liu)內注(zhu)(zhu)射的(de)(de)方式。下(xia)面(mian)對AAV感染(ran)肺(fei)部(bu)常用的(de)(de)三(san)種方法進行介紹。
1、鼻內滴注法(fa)
鼻內滴注(zhu)法是一(yi)種(zhong)直接的AAV感染(ran)法，操作簡(jian)單且對設備要求低，對新手實驗(yan)員也同樣適用(yong)。缺點是AAV顆粒容易沉積在上呼吸道（鼻道、鼻竇(dou)和咽）和胃腸道，如果需要有效(xiao)地感染(ran)到下(xia)呼吸道，則可(ke)能需要更(geng)大劑量的AAV才能實現。
鼻內滴注AAV（兩(liang)種操作手法）
（van Lieshout., et al. Methods Mol Biol, 2019.
Santry, L.A., et al.BMC Biotechnol, 2017.）
操作(zuo)步(bu)驟
①腹腔(qiang)注射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠(shu)麻醉；
注意：為了保(bao)持(chi)小鼠穩定(ding)的呼吸頻率，不(bu)應(ying)過度(du)麻醉。
②甲按(an)上圖所(suo)示(shi)兩種(zhong)方法將小鼠(shu)控制(zhi)好(hao)，防(fang)止(zhi)其用嘴呼吸(xi)；
③乙緩慢滴一滴AAV懸液(ye)于小鼠鼻孔內壁，待液(ye)體(ti)被吸入(ru)后再滴下一滴，重復此操作至40μL AAV懸液(ye)全部滴完；
④使小鼠保持上述姿勢約(yue)30~60s，以(yi)便AAV懸液充(chong)分進入下(xia)呼(hu)吸道；
⑤待小(xiao)鼠(shu)(shu)在籠中恢復10min后(hou)，重復上述操作，再次給藥40μL（每(mei)只小(xiao)鼠(shu)(shu)共(gong)給藥80μL）；
⑥將小鼠(shu)放回籠中直至完全清醒。
2、氣管(guan)插管(guan)術
口腔氣(qi)管(guan)插(cha)(cha)管(guan)術(shu)能夠將病(bing)毒(du)(du)載體(ti)直接灌輸入肺中，卻沒有(you)外科手術(shu)的風(feng)險，并且避(bi)免了上呼吸(xi)道的病(bing)毒(du)(du)顆粒的損失(shi)。由于幾乎所有(you)AAV病(bing)毒(du)(du)顆粒都(dou)會到達(da)肺內，所以要嚴格控制AAV的使用(yong)量(liang)。同(tong)時，與鼻內滴注法相比(bi)，口腔氣(qi)管(guan)插(cha)(cha)管(guan)術(shu)需要一些特殊設備，操作起(qi)來也稍有(you)難度。
氣管(guan)插管(guan)術注(zhu)射AAV
（Das, S., et al. J Vis Exp, 2013.）
操作步驟
①腹腔(qiang)注射氯胺酮(tong)和甲苯噻嗪將小鼠麻醉(zui)；
注意：動(dong)物必(bi)須處(chu)于足(zu)夠深的麻醉(zui)狀(zhuang)態以防止運動(dong)或(huo)對載體(ti)的反應(ying)而打噴嚏或(huo)咳嗽(sou)；
②將小鼠放在(zai)垂直支(zhi)架上，將門牙環置于小鼠上門牙上，讓老鼠的腹部面向(xiang)自己；
③輕輕地把小(xiao)鼠(shu)舌頭拉(la)出來，并(bing)用拇指和(he)食指按(an)住(zhu)，中(zhong)指放在小(xiao)鼠(shu)頸部和(he)塑料支架之間(jian)；
④用食指(zhi)、拇(mu)指(zhi)在(zai)小鼠舌上牽引令其(qi)嘴張(zhang)開，使插管(guan)路(lu)徑伸直，并用中指(zhi)在(zai)頸后調(diao)整頭部角度；
⑤利用光纖作為光源(yuan)和引導者，推動它通(tong)過可視聲帶（如(ru)果看不(bu)到聲帶，用中指作支撐(cheng)，輕輕用力拉(la)舌）；
⑥光纖插入后，同時將導管向前推進約5mm，然后勿移動(dong)導管，取出光纖；
⑦使小鼠平躺，用膠帶將導管固定(ding)在小鼠嘴部防止其移動，另一端用橡皮泥支撐(cheng)；
⑧用注射器(qi)通過導管輸入(ru)80μL AAV；
注意(yi)：在抽取80μL載體之前(qian)，吸(xi)取約(yue)100μL的(de)空氣至(zhi)移液管(guan)尖，以防止載體的(de)丟失，并促進載體深入肺部。
⑨等待(dai)5min，使AAV充分進(jin)入下呼吸道；
⑩把導管(guan)移(yi)出(chu)，將(jiang)小(xiao)鼠輕(qing)輕(qing)從(cong)工作臺拿下，并將(jiang)頭部和(he)胸(xiong)部用折疊的(de)紙巾小(xiao)幅度墊高，以保證小(xiao)鼠順暢的(de)呼吸；
?將小鼠(shu)放回籠中直至完全清醒。
3、氣(qi)管內(nei)注(zhu)射
與(yu)鼻內滴注相比，氣管(guan)內注射能夠提高AAV進入(ru)肺部(bu)的效率；與(yu)口腔氣管(guan)插管(guan)法相比，設(she)備更簡單，操(cao)作(zuo)更容易(yi)(yi)。然而(er)，氣管(guan)內注射具有極高的外科(ke)手術風險，包括出(chu)血(xue)、切口開(kai)裂、感染(ran)以及(ji)較長的恢復期等。不僅如此，由于小鼠氣管(guan)窄小，很(hen)容易(yi)(yi)出(chu)現操(cao)作(zuo)失誤，將AAV注射到氣管(guan)周圍組織或食管(guan)中(zhong)去。
氣(qi)管內注射(she)AAV
（van Lieshout., et al. Methods Mol Biol, 2019. ）
操作步驟
①腹(fu)腔注射(she)氯(lv)胺(an)酮和甲苯噻嗪(qin)將小鼠麻醉(zui)；
②將(jiang)小(xiao)鼠以背(bei)臥姿勢固定(ding)在嚙齒(chi)動物工(gong)作臺上，并將(jiang)其(qi)前爪伸直固定(ding)；
③剃除頸部部分區域的鼠毛，并用碘伏(fu)做(zuo)消毒處理；
④用手術(shu)剪刀在(zai)頸部做(zuo)一個5~7mm的小切口；
⑤手握鑷子固定住(zhu)(zhu)小鼠氣管(guan)，另(ling)一只手握住(zhu)(zhu)注(zhu)射器(qi)，使(shi)注(zhu)射器(qi)針(zhen)頭(tou)斜面朝(chao)上，與氣管(guan)成45°。
注意：一旦針(zhen)(zhen)頭插(cha)(cha)入(ru)，輕(qing)(qing)輕(qing)(qing)地將(jiang)針(zhen)(zhen)頭向(xiang)外移動，遠離小鼠(shu)身體，確定針(zhen)(zhen)頭是否正(zheng)確地插(cha)(cha)入(ru)氣管(guan)。
⑥將40~80μL 的AAV緩慢注入氣管(guan)，等(deng)待5s后慢慢取出針管(guan)；
⑦縫(feng)合傷口，將小鼠放(fang)回籠中恢復(fu)，直到完全清醒(xing)。
三(san)種AAV肺部(bu)給藥途徑的比較(jiao)：
總結：AAV載體(ti)給藥方式(shi)應根據研究人(ren)員的目標位點和技能進行選擇。
本篇暫為大家(jia)分享如(ru)上內容，希望對(dui)大家(jia)的(de)(de)實驗(yan)開展有所幫助，下(xia)期，小V將從客戶(hu)的(de)(de)實際應用效果出(chu)發，為您獻上AAV在肺部應用中的(de)(de)靶向策略之(zhi)應用篇，我們(men)共(gong)同學(xue)習！
文獻參考：
[1]. Meyer-Berg, H., et al., Identification of AAV serotypes for lung gene therapy in human embryonic stem cell-derived lung organoids. Stem Cell Res Ther, 2020. 11(1): p. 448.
[2]. van Lieshout, L.P., J.M. Domm and S.K. Wootton, AAV-Mediated Gene Delivery to the Lung. Methods Mol Biol, 2019. 1950: p. 361-372.
[3]. Santry, L.A., et al., AAV vector distribution in the mouse respiratory tract following four different methods of administration. BMC Biotechnol, 2017. 17(1): p. 43.
[4]. Das, S., et al., A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp, 2013(73): p. e50318.
AAV在肺部應用中的靶向策略『應用篇』（可點擊查看(kan)）
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