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『重磅盤點』AAV在腎臟研究中的應用策略

腎(shen)(shen)臟疾(ji)(ji)病(bing)已成(cheng)(cheng)為威脅人(ren)(ren)類健康的(de)主要(yao)疾(ji)(ji)病(bing)之(zhi)一(yi)，全球(qiu)約有13%人(ren)(ren)口受其影(ying)(ying)響(xiang)。已知由基因(yin)(yin)突(tu)變(bian)(bian)引起的(de)慢性(xing)(xing)腎(shen)(shen)臟疾(ji)(ji)病(bing)的(de)發(fa)病(bing)率(lv)可高(gao)達(da)千分之(zhi)一(yi)，近80種基因(yin)(yin)的(de)突(tu)變(bian)(bian)都與各種遺傳性(xing)(xing)腎(shen)(shen)臟疾(ji)(ji)病(bing)有關(guan)(guan)。然而(er)，由于腎(shen)(shen)臟結構和功能的(de)復(fu)雜性(xing)(xing)，針(zhen)對(dui)腎(shen)(shen)臟疾(ji)(ji)病(bing)的(de)基因(yin)(yin)治療(liao)的(de)研(yan)究(jiu)(jiu)和開發(fa)滯后于肝(gan)臟、神經(jing)肌肉和眼睛等。自20世紀90年代末以來，研(yan)究(jiu)(jiu)人(ren)(ren)員(yuan)已經(jing)開始(shi)利(li)用AAV進行體內外腎(shen)(shen)臟的(de)基因(yin)(yin)傳遞(di)研(yan)究(jiu)(jiu)，并取得一(yi)定(ding)的(de)成(cheng)(cheng)果，然而(er)所帶(dai)來的(de)實際轉導(dao)效果存在很大程度(du)的(de)不(bu)同，這可能與不(bu)同的(de)傳遞(di)方式以及(ji)不(bu)同的(de)AAV血清型等因(yin)(yin)素有關(guan)(guan)。如(ru)何實現或者更大程度(du)上實現外源基因(yin)(yin)在腎(shen)(shen)臟中(zhong)的(de)轉導(dao)成(cheng)(cheng)為影(ying)(ying)響(xiang)腎(shen)(shen)臟基因(yin)(yin)治療(liao)發(fa)展的(de)關(guan)(guan)鍵。

1.注(zhu)射(she)方式(shi)的選擇

圖1. 腎(shen)(shen)臟結(jie)構示意圖和腎(shen)(shen)皮質的顯微圖像

（van der Wouden, E.A., et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 2004.）

給藥(yao)途徑的選擇是基因治(zhi)療有效性(xing)的重要決定(ding)因素(su)。哺乳動(dong)物的(de)(de)腎(shen)(shen)臟(zang)具有嚴格的(de)(de)過濾功能(neng)，排(pai)斥大(da)于(yu)50kDa的(de)(de)蛋白質，此外，腎(shen)(shen)小球內的(de)(de)足(zu)細胞形成直(zhi)徑僅(jin)為10nm的(de)(de)狹縫橫膈膜(mo)，傳(chuan)統的(de)(de)AAV載(zai)體(ti)全(quan)身(shen)給(gei)藥(yao)難以在(zai)腎(shen)(shen)臟(zang)達到足(zu)夠(gou)的(de)(de)表達水平，即(ji)便是高劑(ji)量給(gei)藥(yao)也(ye)會導致AAV集中在(zai)肝臟(zang)等腎(shen)(shen)外器官(guan)中。為了(le)提高病毒(du)載(zai)體(ti)對(dui)腎(shen)(shen)臟(zang)的(de)(de)轉(zhuan)導并降低病毒(du)載(zai)體(ti)對(dui)腎(shen)(shen)外器官(guan)的(de)(de)轉(zhuan)導效率(lv)，除了(le)全(quan)身(shen)給(gei)藥(yao)方式外，近年來，科學(xue)家(jia)陸(lu)續開發了(le)腎臟局部給藥途徑包括腎動脈注(zhu)射(she)、腎靜脈注(zhu)射(she)、經腎實質注(zhu)射(she)、經輸尿管逆行給藥和經腎實質腎盂注(zhu)射(she)等(deng)(圖(tu)2)。

圖2. 腎臟AAV給藥方式

(A) 腎(shen)動脈灌(guan)注(zhu)，通過(guo)導(dao)管(guan)或注(zhu)射器(qi)；(B)腎(shen)靜(jing)脈逆行灌(guan)注(zhu)；(C)逆行輸尿(niao)管(guan)灌(guan)注(zhu)；(D)經腎(shen)囊壁直接向(xiang)腎(shen)實質注(zhu)射。

（Rubin, J.D. and M.A. Barry. Mol Diagn Ther, 2020.）

如下表(biao)所(suo)列，這(zhe)些以手術為基礎的AAV給藥(yao)方(fang)法實現了外源基因在腎臟中不(bu)(bu)同分布模式，且具(ju)有不(bu)(bu)同的特點。

下面對腎靜脈(mo)注射(she)(she)、經(jing)輸尿管逆行(xing)注射(she)(she)和(he)經(jing)腎實質(zhi)腎盂注射(she)(she)三種(zhong)注射(she)(she)方(fang)式進行(xing)簡單分(fen)享：

1. 腎靜脈注射：

①對C57BL/6 小鼠(shu)（4-6 周(zhou)齡，15-20g）進行(xing)麻醉手術，并使小鼠(shu)呈(cheng)仰(yang)臥姿(zi)勢于操作臺(tai)上；

②給小鼠左(zuo)腹(fu)剃(ti)毛(mao)，在(zai)小鼠左(zuo)腹(fu)部做一個(ge)切(qie)口，暴露左(zuo)腎(shen)及腎(shen)蒂，并將腎(shen)靜脈從腎(shen)蒂中游離；

③用(yong)顯微止血夾(jia)夾(jia)住腎靜脈(mo)遠(yuan)端以阻(zu)止病毒原液流出腎臟；

④用30G注射針刺入左腎靜脈近端，將50μL液體（含有 5x10¹⁰個病毒顆(ke)粒基因組拷貝數或 PBS）注入腎靜(jing)脈；

⑤5min后(hou)，拔出注射(she)針(zhen)，移去顯微(wei)止血夾并(bing)壓迫止血片刻，將切口分兩層縫合。

2. 經輸(shu)尿管(guan)腎盂(yu)逆行注射：

①對C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進行麻(ma)醉手術(shu)，并使小鼠呈仰臥姿勢于操作臺(tai)上；

②在小(xiao)鼠左腹部做(zuo)一個切口并(bing)輕輕剖開(kai)，找到輸尿管遠端(duan)和腎(shen)動脈(mo)并(bing)用顯(xian)微(wei)止血夾(jia)(jia)夾(jia)(jia)住；

③用 30G注射(she)針刺破輸尿管，將注射(she)針貼(tie)合于管壁并固定到位，使用 6-0縫線(xian)縫合以(yi)防液體泄漏；

④將尿液輕(qing)輕(qing)吸出，將注射器替換為另一(yi)個含(han)有約 50μL液體（含(han)有 5x10¹⁰個病毒顆粒(li)基(ji)因組拷貝(bei)數或PBS）的注(zhu)射器，并緩慢地(di)將液體逆行注(zhu)入輸尿管；

⑤將注(zhu)射針撤出(chu)，并在注(zhu)射部位的(de)近端(duan)放置一個顯微止(zhi)血夾以防(fang)液體泄漏；

⑥5min后，移去輸尿管(guan)遠端、近端及(ji)腎(shen)動脈上的顯(xian)微止血(xue)夾，用6-0縫線將切口分(fen)兩層縫合。

3. 經腎(shen)實質腎(shen)盂注射：

①對(dui)C57BL/6 小(xiao)鼠（4-6 周齡(ling)，15-20g）進行麻醉手術(shu)，并使小(xiao)鼠呈仰(yang)臥姿勢于操作臺上；

②對小鼠左(zuo)腹(fu)進行(xing)剃毛(mao)處理，切(qie)開一個2cm的切(qie)口暴(bao)露左(zuo)腎和(he)輸尿管，并將周圍器(qi)官和(he)脂肪(fang)輕(qing)輕(qing)分開；

③用顯微(wei)止血夾夾住輸尿管(guan)上段(duan)以阻止病毒原液下流至膀胱(guang)；

④用30G注(zhu)(zhu)射(she)針刺(ci)入左(zuo)腎中極的腎盂(yu)（注(zhu)(zhu)意注(zhu)(zhu)射(she)針頭不(bu)應刺(ci)穿腎盂(yu)），將50μL液體（含5x1010個病毒顆粒基因組(zu)拷(kao)貝數或(huo)PBS）注(zhu)(zhu)入腎盂(yu)；

注：注射(she)針刺入(ru)腎盂(yu)而不(bu)刺穿腎盂(yu)的關鍵在于注意比對穿刺針和小鼠腎臟，并(bing)且在注射(she)針上(shang)做好標記(ji)；

⑤5min后(hou)移去(qu)顯微(wei)止血夾，將切口分(fen)兩層縫合(he)。

2.血清型的選(xuan)擇

腎臟研(yan)究(jiu)中(zhong)常用的AAV載體有 ;AAV2、AAV6、AAV8 和AAV9，其中(zhong)以(yi)AAV9型居多。

1. 在(zai)腎臟的(de)尾(wei)靜脈注(zhu)射轉(zhuan)導中(zhong)，rAAV8和(he)rAAV9的(de)腎臟轉(zhuan)導效率和(he)轉(zhuan)錄活(huo)性優于(yu)rAAV2，rAAV9更優。

圖3. rAAV2-CMV-GFP、rAAV8-CMV-GFP和rAAV9-CMV-GFP在腎臟中的轉導效率和轉錄活性比較

2. Rocca et al. 利用腎靜脈(mo)逆行注射(she)技術將AAV5, AAV6, AAV8以(yi)及AAV9注入(ru)小鼠腎臟，不(bu)僅證實腎靜脈(mo)逆行注射(she)比尾靜脈(mo)注射(she)有更好的腎基因轉導效果，而(er)且發現在四(si)種(zhong)AAV血清型中，AAV9更能同(tong)時高效(xiao)轉導(dao)皮(pi)質(zhi)和(he)髓質(zhi)（AAV6轉導(dao)髓質(zhi)效(xiao)果(guo)更好，但對皮(pi)質(zhi)轉導(dao)效(xiao)率較低(di)），此外，AAV9均能有效(xiao)靶向腎(shen)小(xiao)球和(he)近端小(xiao)管(guan)且在腎(shen)小(xiao)球內效(xiao)率更高（圖4）。

圖4. 腎靜(jing)脈逆行(xing)注射rAAV9是腎基因傳遞(di)的有效方(fang)式

3.注射量(liang)的確(que)定

以小鼠為(wei)例，一般情(qing)況下，AAV在腎臟中的給(gei)藥劑量通常在10E10-10E11VG/只（需要根據注射方式靈活調整），根據病毒實際滴度，注射體積在50-100μL左右。

4.啟(qi)動子的選(xuan)擇

腎臟研究中(zhong)可以選(xuan)擇(ze)廣(guang)譜性(xing)啟動子CMV，也可以選(xuan)擇(ze)特異性(xing)啟動子NPHS1，增加腎臟靶向性(xing)。

圖5. 載體的組織趨向性和轉導(dao)效率檢測

（Jason L Picconi et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2014）

圖(tu)6. NPHS1啟動子的腎臟特異性

（Jason L Picconi et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2014）

5.參考文獻

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AAV在腎(shen)臟研究中的案(an)例分(fen)享(xiang)『應用篇』 （可點(dian)擊查(cha)看(kan)）