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『應用篇』AAV在腎臟研究中的案例分享

01
“Gene deficiency or pharmacological inhibition of PDCD4-mediated FGR signaling protects against acute kidney injury”

 急性腎損傷（Acute kidney injury, AKI）是一種發病率和死亡率均較高的常見疾病，缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury, IRI)、敗血癥或毒素引起的急性和慢性免疫反應會導致AKI。程序性細胞死亡因子4（PDCD4）是一種多功能的腫瘤抑制因子，并參與炎癥的誘導，但其在AKI中的作用和機制尚不清楚。據報道，NOTCH1信號通路的過度激活參與腫瘤的形成、腎臟纖維化及足細胞損傷，表明其在腎臟中發揮重要作用，但其具體調控機制尚不明確。

 在本研究中，作者采用腎缺血再灌注損傷(IRI)和順鉑誘導的AKI小鼠模型，發現PDCD4在AKI小鼠中表達豐富，其缺失可顯著改善AKI小鼠的腎功能障礙和炎癥反應，不僅如此，急性腎小管壞死患者的腎臟活檢中也發現PDCD4表達上調。進一步研究發現，酪氨酸激酶家族成員Fgr的過表達可顯著加重AKI小鼠模型的病癥，并消除了PDCD4缺失對腎臟的保護作用。機制上，PDCD4通過磷酸化STAT3正向調控FGR/ NOTCH1介導的細胞凋亡和炎癥通路進而加重AKI。全身給藥帕納替尼（ponatinib，一種酪氨酸激酶抑制劑）可阻斷該通路改善小鼠腎損傷。本研究揭示了PDCD4在AKI中的作用和分子機制，提示在多個水平上靶向PDCD4信號通路可能是治療AKI的有效策略，為開發改善AKI的療法提供了新見解。

圖1. PDCD4在AKI中的作用及調控機制

為探究Fgr是否是連接PDCD4和AKI炎癥反應間的關鍵調節因子，作者將rAAV9-Fgr-GFP通過腎實質注入Pdcd4^-/-缺血小鼠體內，1個月后通過熒光顯微鏡觀察到強烈的綠色熒光，Western Blot也證實了Fgr成功過表達（圖2）。

圖2. AAV9-Fgr在Pdcd4^-/-缺血小鼠腎臟內成功過表達

如圖3所示，FGR的過表達消除了Pdcd4^-/-缺血小鼠的腎損傷減輕癥狀，具體表現為血清肌酐SCr和血尿素氮BUN升高，腎形態損傷惡化，細胞死亡、炎癥反應以及巨噬細胞、中性粒細胞浸潤增強。重要的是，FGR的過表達還逆轉了Pdcd4^-/-缺血小鼠NOTCH1的下調。上述結果表明Fgr在AKI中是PDCD4和炎癥反應的關鍵調節因子。

圖3 . 過表達Fgr可消除Pdcd4^-/-缺血小鼠腎臟損傷和炎癥反應的減輕

02
“Long noncoding RNA lnc-TSI inhibits renal fibrogenesis by negatively regulating the TGF-β/Smad3 pathway”

 慢性腎臟病導致的腎纖維化是終末期腎衰竭（尿毒癥）的主要原因。研究表明，轉化生長因子TGF-β1信號通路在腎間質纖維化過程中起到重要作用，在TGF-β刺激下，信號轉運蛋白Smad3的磷酸化是整個TGF-β/Smad3通路活化的關鍵環節。然而敲除Smad3治療腎纖維化的同時也會引發自身免疫性疾病，因此，尋找一種能抑制TGF-β/Smad通路減輕腎纖維化而又不損害免疫系統的替代方法是至關重要的。研究表明lncRNA在腎臟疾病的發病機制中發揮關鍵作用，然而研究大多針對小鼠lncRNA，關于lncRNA在人腎臟中的作用研究相對較少。此外，lncRNA在調節人類腎纖維化中的生物學作用也尚不清楚。

 在本研究中，作者用TGF-β進行誘導，并通過高通量篩選技術，觀察腎小管上皮細胞中差異表達的lncRNA的表達，發現在TGF-β刺激下lnc-TSI的表達顯著增加。在生物學功能上，研究者發現lnc-TSI通過特異性抑制Smad3的磷酸化負向調控TGF-β/Smad3信號通路。分子機制研究發現，lnc-TSI可以通過結合Smad3的MH2結構域而阻止TGFβ I型受體和Smad3的結合。動物實驗表明，通過腺相關病毒AAV9實現人源基因lnc-TSI在小鼠腎臟中的過表達有效防治了小鼠腎纖維化模型的發生發展。本研究為腎纖維化的治療提供了一個新的潛在靶點。

 研究者采用單側輸尿管結扎（Unilateral Ureteral Obstruction, UUO）方法，于術前一周進行小鼠腎靜脈注射。用生理鹽水將10μL腺相關病毒（AAV9-lnc-TSI，1×10E14 vg/mL）稀釋至100μL體積，每只小鼠使用100μL病毒稀釋液，于造模一周后處死小鼠。Northern blot實驗證明，這種感染方法可以使lnc-TSI主要表達于腎臟中。同時，使用RNA原位雜交發現，病毒感染使lnc-TSI主要表達于腎皮質的腎小管上皮細胞中，皮質中被感染成功的細胞百分比約為40-60%。

圖4. lnc-TSI在腎臟組織中的過表達

 Northern blot結果顯示，lnc-TSI在小鼠腎臟中成功過表達。并且，在小鼠腎臟中特異過表達lnc-TSI可以有效減輕單側輸尿管結扎（UUO）所致的腎間質纖維化，表現為腎間質纖維化評分（TIF index）降低和腎小管中pSmad3蛋白的表達下降。

圖5. 腎臟組織中檢測lnc-TSI的表達和UUO所致的腎間質纖維化病變程度

03
“Hyperoside ameliorates diabetic nephropathy induced by STZ via targeting the miR-499e5p/APC axis”

 糖尿病腎病（DN）是糖尿病的嚴重并發癥，金絲桃苷已被廣泛報道可用于改善糖尿病相關疾病，但金絲桃苷調控DN的具體作用及機制尚未明確。現有研究表明，金絲桃苷可通過調節microRNA或靶向AKT/ mTOR通路調控DN進展，此外，在DN中某些miRNAs能靶向Wnt/b-catenin信號通路，而這一通路的激活有助于腎臟的保護。

本研究中，作者通過建立糖尿病腎病小鼠模型，檢測細胞外基質積累、炎癥反應和細胞凋亡情況，發現金絲桃苷不僅能減輕高糖誘導的細胞損傷，還能改善糖尿病癥狀和腎功能障礙。機制上，miR-499-5p是腺瘤性息肉病基因APC (Wnt信號通路的負調控因子) 的上游負調節因子，金絲桃苷通過誘導miR-499-5p的上調抑制APC的表達，繼而激活Wnt/b-catenin信號通路。本研究揭示了金絲桃苷通過靶向miR-499-5p/APC通路改善糖尿病腎病，為糖尿病腎病的治療提供了一種潛在的策略。

為探究金絲桃苷的具體調控機制，研究人員將AAV9-miR-499-5p及AAV9-APC通過腎靜脈注射至小鼠左腎組織中，RT-qPCR檢測證實miR-499-5p及APC在小鼠左腎組織中成功過表達（圖6）。數據表明miR-499-5p和APC的過表達對糖尿病腎病小鼠的血糖、體重及血壓等指標均無影響。此外，miR-499-5p對糖尿病腎病小鼠病癥的抑制作用可被APC的過表達抵消（圖7）。

圖6. miR-499-5p及APC在小鼠腎組織中的過表達檢測

圖7. 過表達APC可逆轉miR-499-5p對腎損傷和纖維化的抑制影響