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IF=8.702｜北京協和醫院研究團隊發現血-睪屏障調控新機制！

研究背景

睪(gao)丸(wan)支持(chi)細(xi)胞構成的(de)血液-睪(gao)丸(wan)屏(ping)障（BTB）對于維持(chi)精(jing)子產生的(de)獨特(te)微環境至關重要。去甲基化酶ALKBH5在小鼠(shu)睪(gao)丸(wan)支持(chi)細(xi)胞中大量表達，并以m6A依賴(lai)的(de)方式調節精(jing)子產生，但目前尚不清楚ALKBH5是否參(can)與BTB的(de)調節。在本(ben)研究中作者(zhe)利用AAV8 -shALKBH5構建了睪(gao)丸(wan)支持(chi)細(xi)胞特(te)異性ALKBH5敲低小鼠(shu)，用以探(tan)討(tao)ALKBH在BTB中的(de)功能(neng)，發現ALKBH5通(tong)過(guo)調控Cdh2 mRNA翻譯(yi)來調節BTB完整性。

結果展示

1. 睪丸支持細胞中的ALKBH5參與BTB完整性的調節

作(zuo)者通過前期研(yan)究發(fa)現ALKBH5在小(xiao)(xiao)(xiao)鼠睪丸支持(chi)細(xi)胞中(zhong)大量表(biao)(biao)達，為了(le)闡明支持(chi)細(xi)胞ALKBH5與BTB之間的(de)聯系，作(zuo)者利用AAV8-shALKBH5構建了(le)支持(chi)細(xi)胞ALKBH5特異性(xing)(xing)敲(qiao)(qiao)低小(xiao)(xiao)(xiao)鼠模型，BTB完(wan)整性(xing)(xing)測定表(biao)(biao)明，ALKBH5敲(qiao)(qiao)低小(xiao)(xiao)(xiao)鼠的(de)曲精小(xiao)(xiao)(xiao)管BTB完(wan)整性(xing)(xing)受損，但對照小(xiao)(xiao)(xiao)鼠的(de)曲精小(xiao)(xiao)(xiao)管中(zhong)BTB未受損，表(biao)(biao)明支持(chi)細(xi)胞中(zhong)的(de)ALKBH5參(can)與BTB完(wan)整性(xing)(xing)的(de)調節。

圖1 ALKBH5參與BTB完整性的調節

2. ALKBH5調節Cdh2 mRNA的m6A水平及其翻譯

ALKBH5主要通(tong)(tong)過(guo)m6A（mRNA N6-腺苷酸(suan)甲基(ji)化）調控(kong)基(ji)因表達，為了(le)研究ALKBH5調控(kong)BTB完整性的機制，作者將小鼠支(zhi)持(chi)細胞(bao)TM4中的ALKBH5進行沉默(mo)及m6A-seq分析。發(fa)(fa)現ALKBH5表達降低后(hou)總(zong)體m6A水平(ping)增(zeng)加，并鑒定出1416個(ge)高甲基(ji)化RNA和615個(ge)低甲基(ji)化RNA，其(qi)中一(yi)些基(ji)因集(ji)與形成BTB的細胞(bao)骨(gu)架相關。通(tong)(tong)過(guo)進一(yi)步(bu)的篩選發(fa)(fa)現ALKBH5沉默(mo)導(dao)致Cdh2 mRNA的m6A水平(ping)顯著(zhu)增(zeng)加，其(qi)中Cdh2 mRNA編碼(ma)BTB中的一(yi)種重要結(jie)構蛋白N-鈣粘蛋白，m6A IP qPCR實驗再(zai)次證實這一(yi)結(jie)果，此(ci)外作者還發(fa)(fa)現Cdh2 mRNA與ALKBH5蛋白結(jie)合，表明Cdh2 mRNA是支(zhi)持(chi)細胞(bao)中ALKBH5的去甲基(ji)化底(di)物。

圖2 Cdh2 mRNA的鑒定

3. ALKBH5通過Cdh2調節BTB完整性

多(duo)聚體分(fen)析結果表明，沉(chen)默(mo)ALKBH5后Cdh2 mRNA翻譯(yi)效率(lv)呈上(shang)升趨勢，但沒有觀察到(dao)Cdh2 mRNA含(han)量(liang)和(he)選擇性(xing)(xing)剪接方式的(de)變化。因此，作者測定翻譯(yi)相關的(de)m6A結合蛋白(bai)與Cdh2 mRNA之間的(de)關系，發(fa)現Cdh2 mRNA和(he)IGF2BP1、IGF2BP2和(he)IGF2BP3之間存在(zai)(zai)強烈相互(hu)作用，同時(shi)Igf2bp1, Igf2bp2及Igf2bp3的(de)沉(chen)默(mo)均導(dao)致N-鈣(gai)粘蛋白(bai)含(han)量(liang)顯著降低，Western blot實驗發(fa)現N-鈣(gai)粘蛋白(bai)表達(da)在(zai)(zai)沉(chen)默(mo)Alkbh5后上(shang)調。這些(xie)結果表明：ALKBH5通(tong)過(guo)調節Cdh2 mRNA的(de)m6A水平，并在(zai)(zai)IGF2BP1/2/3幫(bang)助(zhu)下影響其翻譯(yi)效率(lv)。N-鈣(gai)粘蛋白(bai)是(shi)基(ji)底(di)內質特化的(de)重要結構分(fen)子，Alkbh5敲(qiao)除小鼠(shu)睪(gao)丸中的(de)基(ji)底(di)內質特異性(xing)(xing)肌(ji)動蛋白(bai)束嚴重紊(wen)亂(luan)，表明小鼠(shu)睪(gao)丸支(zhi)持細胞中的(de)ALKBH5通(tong)過(guo)調節Cdh2 mRNA翻譯(yi)效率(lv)，以調控血液-睪(gao)丸屏(ping)障的(de)完整性(xing)(xing)。

圖3 ALKBH5通過Cdh2調節BTB完整性

本(ben)研究發現，ALKBH5調(diao)節小鼠睪丸支持細(xi)胞Cdh2 mRNA的m6A水平，影響Cdh2 mRNA翻譯效率，并(bing)通過N-鈣粘蛋白參(can)與調(diao)節基底內質特化，繼而(er)調(diao)控BTB的完整(zheng)性(xing)。