欧美日韩亚洲视频在线,精品视频在线观看免费播放,精品一区二区三区欧美人妖,国产精品福利片免费看,嫩草在线视频WWW免费看,在线精品国内视频秒播,国产痴汉一区二区三区在线观看,青青草成人免费在线

干貨篇｜AAV在肌肉組織中的靶向應用策略

肌(ji)肉是(shi)(shi)人(ren)體的(de)(de)重要組成部(bu)分(fen)，不(bu)僅是(shi)(shi)多種肌(ji)營養不(bu)良疾(ji)病基(ji)因治療的(de)(de)靶(ba)組織(zhi)(zhi)，還可作為(wei)生(sheng)產和分(fen)泌治療遠端(duan)器官疾(ji)病功能(neng)蛋(dan)白的(de)(de)生(sheng)物工廠，肌(ji)肉組織(zhi)(zhi)的(de)(de)這些特征(zheng)使(shi)其(qi)成為(wei)開(kai)發基(ji)因治療策(ce)(ce)略的(de)(de)通用平臺，用于(yu)遞(di)送相關疾(ji)病功能(neng)基(ji)因。AAV載體是(shi)(shi)將基(ji)因轉移到骨骼(ge)肌(ji)和心肌(ji)等肌(ji)肉組織(zhi)(zhi)的(de)(de)理想載體，經AAV轉導后肌(ji)肉細(xi)胞可以表達功能(neng)性重組蛋(dan)白，并將這些蛋(dan)白分(fen)泌到血液中(zhong)進行全(quan)身遞(di)送，通過(guo)這種策(ce)(ce)略用于(yu)糖尿病、動脈粥(zhou)樣硬化、血友病及癌癥(zheng)等的(de)(de)疾(ji)病治療，目前由AAV介導的(de)(de)肌(ji)肉基(ji)因治療已逐步邁入臨床(chuang)。本(ben)期我們整理了AAV在肌(ji)肉組織(zhi)(zhi)的(de)(de)靶(ba)向策(ce)(ce)略以及部(bu)分(fen)案(an)例，希望(wang)對(dui)大家的(de)(de)研究有所幫助。

在(zai)肌(ji)肉組織的(de)(de)(de)研(yan)究中，除了可(ke)以選(xuan)(xuan)擇CMV和(he)CAG等常(chang)用的(de)(de)(de)廣譜啟(qi)動子，還可(ke)選(xuan)(xuan)擇肌(ji)肉特(te)異(yi)性(xing)啟(qi)動子MCK，以實現基因在(zai)肌(ji)肉中高效(xiao)和(he)特(te)異(yi)性(xing)的(de)(de)(de)表達。
維真生物肌肉(rou)組織(zhi)特異性啟動子(zi)可(ke)供選擇：

名稱	大小(xiao)	來源	描(miao)述
MCK	1.3 kb	小鼠	肌酸(suan)激酶(mei)基因啟(qi)動子
3×enhancer MCK	728 bp	小鼠	修改(gai)的肌酸激酶基因啟(qi)動子

二(er)、AAV血(xue)清型的選擇

根據文(wen)獻(xian)報(bao)道，AAV1、2、6、7、8和9均可有效轉導肌(ji)肉組織，但(dan)若要實現基因在(zai)肌(ji)肉組織的(de)更高特異(yi)性地表達(da)，通常是(shi)建議結合(he)合(he)適(shi)的(de)血清型、肌(ji)肉特異(yi)性啟動子以及適(shi)當的(de)給藥方式來實現。
1、AAV9結合CK6啟動(dong)子(zi)，通過頸(jing)靜(jing)脈(mo)注射的(de)方式可高(gao)效、選(xuan)擇性的(de)將(jiang)基因(yin)傳遞到骨骼肌。

AAV9結合CK6啟(qi)動(dong)子(zi)經頸靜(jing)脈注射后高效靶向缺(que)血性(xing)骨骼(ge)肌

（Katwal AB, et al. Gene Ther. 2013）

實驗動物	血(xue)清型	啟動子(zi)	注射(she)方式	病毒用量
成年雄性 C57BL/6小鼠	AAV9	CK6	頸靜脈 注射	4.15×1011 vg/mouse

2、AAV1和AAV6均可有效靶(ba)向橫紋肌，由于AAV6與(yu)肝素(su)有較好的親(qin)和力，與(yu)AAV1相比，無論是通過(guo)肌肉注射還是靜脈(mo)注射，AAV6都能以更高的效率持續轉導橫紋肌。

實驗動物	血清型	啟動子(zi)	注射部位	病毒用量	注射體積
3月齡(ling)雄性 C57BL/6小(xiao)鼠(shu)	AAV1 AAV6	CMV	雙側脛骨 前(qian)肌	108vg 109vg 1010vg	25 μL病毒稀釋液

相比AAV1，AAV6經靜脈注射后有效靶(ba)向橫紋肌

（Arnett AL, et al.Gene Ther.2013）

實驗動物	血清型	啟動子	注射部位	病毒用量	注射體積
3月齡雄性 C57BL/6小鼠	AAV1 AAV6	CMV	尾靜(jing)脈 注(zhu)射	2x1012vg	200 μL

3、來自美國布羅德研(yan)究(jiu)(jiu)所(suo)和哈佛(fo)大學等(deng)研(yan)究(jiu)(jiu)機構的(de)(de)研(yan)究(jiu)(jiu)人員在小鼠(shu)和靈長類動(dong)物體(ti)(ti)(ti)內定向進(jin)化出一種(zhong)工程化改造的(de)(de)AAV載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)— MyoAAV，研(yan)究(jiu)(jiu)顯示這種(zhong)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)能夠高效靶向肌肉(rou)組(zu)織(zhi)，遞(di)送到(dao)(dao)肌肉(rou)組(zu)織(zhi)的(de)(de)效率是傳(chuan)統病毒載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)的(de)(de)10倍以上。同時，與傳(chuan)統遞(di)送載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)相比，該載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)在遺(yi)傳(chuan)性(xing)肌肉(rou)疾(ji)病中的(de)(de)治療劑量(liang)降低大約100到(dao)(dao)250倍，可有效降低肝(gan)臟損(sun)傷和其他嚴重副作用的(de)(de)風險。

（Mohammadsharif Tabebordbar，et al.Cell.2021）

實驗(yan)動物(wu)	血清型	啟(qi)動子	注(zhu)射 方式(shi)	病毒用量	檢測 時間
8周齡 C57BL/6J小鼠	AAV9、 MyoAAV 1A	CMV	系統 注射	1E+12 vg （~4E+13 vg/kg）	注射后 2周

三(san)、AAV給藥途徑(jing)的(de)選擇

載體(ti)給藥(yao)(yao)途徑可以(yi)(yi)影響AAV在體(ti)內的(de)組(zu)織趨向(xiang)性和轉導效(xiao)率(lv)。多種AAV給藥(yao)(yao)途徑可以(yi)(yi)實現局部(bu)或(huo)全身的(de)肌肉基因(yin)轉移，以(yi)(yi)達(da)到不同(tong)的(de)治療(liao)目的(de)，如肌肉注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)、逆(ni)行經靜(jing)脈肢體(ti)灌注(zhu)(zhu)(zhu)、冠(guan)狀動脈內灌注(zhu)(zhu)(zhu)、再循環給藥(yao)(yao)、腹腔注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)和靜(jing)脈給藥(yao)(yao)，以(yi)(yi)及針對特定器官的(de)方(fang)法比如心(xin)包內注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)和心(xin)內膜注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)等。
其中(zhong)(zhong)，肌(ji)(ji)肉(rou)注射(she)簡單(dan)方便，可以將載體(ti)輸送到(dao)目標肌(ji)(ji)肉(rou)群(qun)，小鼠肌(ji)(ji)肉(rou)注射(she)的(de)常見部位包括脛骨前肌(ji)(ji)、腓腸(chang)肌(ji)(ji)和股四頭肌(ji)(ji)；逆行經(jing)靜(jing)脈肢體(ti)灌注針對更多的(de)肌(ji)(ji)肉(rou)群(qun)，更加(jia)適(shi)合治療影響大肌(ji)(ji)肉(rou)群(qun)的(de)疾病；心包內(nei)注射(she)通常用于新生動(dong)物，可同時轉導心臟和隔膜(mo)；心內(nei)膜(mo)注射(she)在(zai)犬和NHP模型中(zhong)(zhong)可實(shi)現心臟基(ji)(ji)因(yin)的(de)整體(ti)遞(di)送；冠狀動(dong)脈內(nei)灌注將治療基(ji)(ji)因(yin)傳(chuan)遞(di)到(dao)心臟已應(ying)用于臨(lin)床試驗；腹腔(qiang)注射(she)和靜(jing)脈給藥可實(shi)現全(quan)身的(de)肌(ji)(ji)肉(rou)基(ji)(ji)因(yin)轉移，但易(yi)產生脫靶(ba)和免疫(yi)毒(du)性(xing)。

方法		優點	缺點
原位 注(zhu)射	肌肉注(zhu)射、逆行經靜脈肢體(ti)灌(guan)注(zhu)、冠狀動(dong)脈內灌(guan)注(zhu)、心包(bao)內注(zhu)射、心內膜注(zhu)射、再循環給(gei)藥(yao)	轉(zhuan)導效率高； 靶向(xiang)性(xing)強； 低(di)免疫反應；	不能(neng)轉導大肌肉(rou)群
系統(tong)性(xing)注射	腹腔注射靜脈給藥	廣泛轉導(dao)大肌肉群乃至全身肌肉	高(gao)劑量載體需(xu)求(qiu)易產生脫靶和(he)免疫毒性；AAV血清型有限

下面簡述肌肉注射方式的操作步驟：
1、對小鼠(shu)進行稱(cheng)重，腹腔注射甲苯噻嗪/氯胺酮混(hun)合液將小鼠(shu)麻醉；
2、對小鼠(shu)右脛前肌進行(xing)刮(gua)毛及(ji)消毒處理；
3、使用(yong)適當(dang)大小(xiao)的注射器及針(zhen)(zhen)頭，以避免觸碰到坐骨神經的方式入針(zhen)(zhen)，將病毒(du)載體注入右(you)脛前肌；
4、將針頭(tou)緩慢(man)抽出，輕(qing)輕(qing)施加壓(ya)力以防止回流；
5、將(jiang)小(xiao)鼠(shu)放在加熱墊上直(zhi)至恢(hui)復，然后(hou)放回籠中飼養觀察，注射病(bing)毒4周后(hou)可檢測轉(zhuan)基因(yin)的表(biao)達。

小鼠肌肉注射示意(yi)圖

（//www.theodora.com/rodent_laboratory/injections.html）

四、不同注射方式的AAV給藥劑量

注射 方式	推薦(jian) 劑量	推薦(jian)注(zhu)射體(ti)積	推薦 血(xue)清(qing)型(xing)	實驗 動物
靜脈 注射	1×1012~ 1×1014 vg/kg	200μl病毒(du)稀釋液	AAV6- AAV9	成(cheng)年 小(xiao)鼠(shu)
肌肉 注射	5×108~ 5×1010 vg/site	脛前肌/腓腸肌： 20~25μL 股(gu)四頭肌： 50~100μL	AAV1/2/ 6/7/8/9	成年 小鼠
心包內注射（針(zhen)對(dui)心肌）	2.5x109~ 2.5x1011 vg	50μL	AAV8 AAV9	新生 小鼠
左心室壁注射（針對心肌）	5x1010~ 5x1011 vg/rat	不超過(guo)250μL， 50μL/次(ci) （總量超過(guo)250μL可能會導(dao)致心(xin)臟(zang)損傷或者死亡）	AAV9	成(cheng)年 大鼠

注：選擇的血(xue)清型(xing)和載體的濃度決定了每種(zhong)注射方式的給藥劑量，具(ju)體實驗時應綜合考慮各種(zhong)因素。

1、Wang D, et al.The potential of adeno-associated viral vectors for gene delivery to muscle tissue. Expert Opin Drug Deliv. 2014 Mar;11(3):345-364.
2、Qiao C, et al.Gene therapy in skeletal muscle mediated by adeno-associated virus vectors. Methods Mol Biol. 2011;807:119-40.
3、Katwal AB, et al. Adeno-associated virus serotype 9 efficiently targets ischemic skeletal muscle following systemic delivery. Gene Ther. 2013 Sep;20(9):930-8.
4、Arnett AL, et al.Heparin-binding correlates with increased efficiency of AAV1- and AAV6-mediated transduction of striated muscle, but negatively impacts CNS transduction. Gene Ther. 2013 May;20(5):497-503.
5、Gruntman AM, et al.Gene transfer in skeletal and cardiac muscle using recombinant adeno-associated virus. Curr Protoc Microbiol. 2013;Chapter 14:Unit 14D.3.
6、Kwong JQ, et al.The mitochondrial calcium uniporter underlies metabolic fuel preference in skeletal muscle. JCI Insight. 2018 Nov 15;3(22):e121689.
7、Wu Y, et al.Endothelium-targeted delivery of PPARδ by adeno-associated virus serotype 1 ameliorates vascular injury induced by hindlimb ischemia in obese mice. Biomed Pharmacother. 2022 Jul;151:113172.
8、Witcher PC, et al.Expression of Myomaker and Myomerger in myofibers causes muscle pathology. Skelet Muscle. 2023 May 1;13(1):8.
9、Mohammadsharif Tabebordbar，et al.Directed evolution of a family of AAV capsid variants enabling potent muscle-directed gene delivery across species .Cell.2021