『AAV-骨骼系統』如何實現外源基因在骨骼系統的高效表達？
骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)骼(ge)存在(zai)于人和(he)(he)動物(wu)體內，為肌肉、肌腱和(he)(he)韌(ren)帶提供了附著點，從而(er)使運動成(cheng)(cheng)為可能。骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)骼(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)譜(pu)系(xi)涵蓋了在(zai)穩(wen)態和(he)(he)損傷期間分別維持和(he)(he)修復骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)骼(ge)的(de)多(duo)(duo)種(zhong)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，包括成(cheng)(cheng)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)、骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)軟骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)，這些骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)骼(ge)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)類(lei)型(xing)主(zhu)要參與骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)骼(ge)和(he)(he)軟骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)的(de)形(xing)成(cheng)(cheng)，而(er)負責骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)骼(ge)吸(xi)收的(de)破骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)則來自造(zao)血(xue)譜(pu)系(xi)。通(tong)過成(cheng)(cheng)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)和(he)(he)破骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)活性之間的(de)平衡來維持正(zheng)常(chang)的(de)骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)穩(wen)態。骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)骼(ge)系(xi)統(tong)通(tong)過其支(zhi)撐身體、保(bao)護內臟(zang)器官、參與運動功(gong)能、造(zao)血(xue)功(gong)能以及調節礦物(wu)質(zhi)平衡等主(zhu)要作用來維持身體健康，但由于多(duo)(duo)種(zhong)因(yin)素(su)的(de)相互作用，機體功(gong)能易出現退化，容易導致骨(gu)(gu)(gu)(gu)(gu)骼(ge)疾病的(de)發(fa)生，對(dui)人們的(de)生活造(zao)成(cheng)(cheng)諸多(duo)(duo)困擾。
AAV憑借安全(quan)性高、免疫(yi)原性低(di)、宿主(zhu)范圍廣及表達穩定等特點，被視(shi)為(wei)最有前途的基因(yin)轉移載體之一，目前已被廣泛應(ying)用于多種疾病的基(ji)因(yin)治療。本(ben)期我(wo)們將和大家一起學(xue)習AAV在骨骼(ge)系統中的應(ying)用方法(fa)。
溫馨提示：以上來(lai)自于文(wen)(wen)獻(xian)(xian)報道，AAV在骨骼系統中的轉導(dao)效(xiao)率應結合(he)血清型、啟動(dong)子(zi)及注射方(fang)式等多方(fang)面綜合(he)考慮，建議在進行實驗(yan)前(qian)根據具體想要感染的組織細胞查閱相關(guan)文(wen)(wen)獻(xian)(xian)并進行預實驗(yan)的摸索(suo)。
一. AAV血清型
案例 1
研究團隊評估了在(zai)體(ti)外不同AAV血(xue)清型對小鼠(shu)顱骨(gu)(gu)成(cheng)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)（COB）、骨(gu)(gu)髓衍生的(de)(de)破骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)前體(ti)（BM-OCP）和(he)軟骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)祖細(xi)胞(bao)（ATDC5）的(de)(de)轉(zhuan)導(dao)效率(lv)，發現(xian)rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7，rAAV9，rAAVrh.10和(he)rAAVrh.39這八(ba)種AAV載體(ti)能(neng)(neng)夠高效轉(zhuan)導(dao)COB。其中，rAAV1，rAAV4，rAAV5，rAAV6，rAAV7和(he)rAAV9也能(neng)(neng)轉(zhuan)導(dao)BM-OCP，而(er)rAAV1，rAAV6，rAAVrh.10和(he)rAAVrh.39則能(neng)(neng)轉(zhuan)導(dao)ATDC5；此外，rAAV2和(he)rAAV6.2實現(xian)了ATDC5細(xi)胞(bao)的(de)(de)有(you)效轉(zhuan)導(dao)，但在(zai)COB中轉(zhuan)導(dao)效果較差。接著(zhu)，將體(ti)外篩選(xuan)出的(de)(de)八(ba)種血(xue)清型AAV通過(guo)關(guan)節腔注射到2月(yue)齡小鼠(shu)體(ti)內，發現(xian)僅AAV9能(neng)(neng)夠有(you)效轉(zhuan)導(dao)成(cheng)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)、破骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)和(he)骨(gu)(gu)細(xi)胞(bao)等。
（Yang YS, et al. Nat Commun.2019）
案例 2
通過膝關節注射不同(tong)AAV血清(qing)型(xing)（AAV1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 6.2, rh8, rh10, rh39, rh43）至不同(tong)樣本軟骨(gu)組織中，發(fa)現與其他AAV血清(qing)型(xing)相比，AAV2和(he)AAV6.2在體內(nei)外軟骨(gu)細胞的基因遞送中均表現出很高的轉導效(xiao)率。
不同AAV血清(qing)型在(zai)小鼠(shu)軟骨組織中的轉(zhuan)導效率(lv)比(bi)較
（Dong Suk Yoon,et al. Int. J. Med. Sci. 2021）
二. 啟動子
為增強AAV對(dui)骨骼(ge)系統(tong)的特(te)異(yi)性靶向，除了可以選擇(ze)CMV等廣譜啟(qi)動子(zi)外，還有多種骨骼(ge)特(te)異(yi)性啟(qi)動子(zi)：
體(ti)內用于靶向(xiang)成(cheng)骨細胞(bao)和骨細胞(bao)的啟(qi)動子概述
（Kitase Y, Prideaux M. Bone. 2023）
在CAG、Col2.3和(he)Sp7三種(zhong)啟動子的(de)驅(qu)動下，將AAV8-tdTomato（5×1011vg）經尾靜脈注射至(zhi)小鼠體(ti)內，檢測發現三種(zhong)構建體(ti)均成功轉(zhuan)導(dao)(dao)脛(jing)骨細胞(bao)(bao)；值得注意(yi)的(de)是(shi)，骨特異性啟動子Col2.3和(he)Sp7驅(qu)動的(de)tdTomato表(biao)達與成骨細胞(bao)(bao)標(biao)記物AP共定(ding)位且(qie)轉(zhuan)導(dao)(dao)水平(ping)相(xiang)似。其中Col2.3介導(dao)(dao)骨膜和(he)成骨細胞(bao)(bao)的(de)轉(zhuan)導(dao)(dao)，而Sp7主要介導(dao)(dao)成骨細胞(bao)(bao)的(de)轉(zhuan)導(dao)(dao)。
全身給藥后(hou)，攜帶骨細胞特(te)異(yi)性(xing)啟動(dong)子的AAV8選(xuan)擇(ze)性(xing)靶向成骨細胞
（ Lee, Lucinda R. , et al. Methods, Clinical Development. 2019）
三. 注射方式
針對骨骼(ge)系統的(de)(de)AAV注(zhu)(zhu)射(she)(she)方(fang)式可分為(wei)三(san)種：針對骨骼(ge)系統特異性(xing)的(de)(de)骨關(guan)(guan)節(jie)腔(qiang)注(zhu)(zhu)射(she)(she)、靜脈注(zhu)(zhu)射(she)(she)以及針對骨髓(sui)的(de)(de)骨內注(zhu)(zhu)射(she)(she)。關(guan)(guan)節(jie)腔(qiang)注(zhu)(zhu)射(she)(she)（Intra-Articular Injection）是首選的(de)(de)給(gei)藥方(fang)法。與全身給(gei)藥相比(bi)，關(guan)(guan)節(jie)內注(zhu)(zhu)射(she)(she)降(jiang)低(di)(di)了(le)非靶器官發生不良(liang)事(shi)件的(de)(de)可能性(xing)，提高了(le)治療藥物在關(guan)(guan)節(jie)腔(qiang)內的(de)(de)有(you)效(xiao)濃度，并且降(jiang)低(di)(di)了(le)成本。通(tong)過該注(zhu)(zhu)射(she)(she)方(fang)式給(gei)藥AAV可以將(jiang)基因高效(xiao)的(de)(de)傳(chuan)遞至關(guan)(guan)節(jie)，滑膜中(zhong)的(de)(de)成纖維樣滑膜細胞(bao)（FLS）、巨噬細胞(bao)、樹突狀細胞(bao)、B細胞(bao)和(he)T細胞(bao)等均可被有(you)效(xiao)轉導。
操作步驟（以膝關(guan)節注(zhu)射為例）：
1) 抓(zhua)握固(gu)定小鼠(shu)，對膝關節作備皮處理；
2) 用75％乙醇消毒后(hou)，握緊小鼠下肢，屈曲(qu)60°；
3) 取微量注(zhu)(zhu)射(she)器于(yu)髕骨下(xia)方(fang)腱外緣進針(zhen)，稍(shao)向內下(xia)穿過關節囊后即感(gan)到有落空感(gan)，此(ci)時不再進針(zhen)并(bing)緩慢注(zhu)(zhu)射(she)，注(zhu)(zhu)射(she)完(wan)畢后靜置10s；
4) 旋(xuan)轉拔出注射(she)器(qi)，對注射(she)位置作75％乙醇消毒處(chu)理。
小鼠膝(xi)關節注射示意圖
（//www.clodrosome.com/animal-injection/）
四. 客戶案例
骨關節炎 / 案例1
文章(zhang)標題(ti)：CircSERPINE2 protects against osteoarthritis by targeting miR-1271 and ETS-related gene
發表(biao)期(qi)刊(kan)：Annals of the Rheumatic Diseases (IF 27.973)
合作客戶：浙江大學(xue)(xue)醫(yi)學(xue)(xue)院附(fu)屬(shu)邵(shao)逸夫醫(yi)院范順武教授團(tuan)隊
CircSERPINE2過表(biao)達(da)可緩解OA兔的癥狀
研究(jiu)團(tuan)隊將(jiang)AAV-CircSERPINE2-wt或AAV-CircSERPINE2-mut通過關節內注(zhu)(zhu)射(she)入(ru)前交叉韌帶橫切(ACLT)誘導的OA兔(tu)體內。結(jie)果顯(xian)(xian)(xian)(xian)示OA兔(tu)在注(zhu)(zhu)射(she)AAV-CircSERPINE2-wt后軟骨(gu)表(biao)面(mian)得到了(le)改(gai)善，AAV-CircSERPINE2-mut組則無(wu)改(gai)善。OARSI評分(fen)顯(xian)(xian)(xian)(xian)示，AAV-CircSERPINE2-wt顯(xian)(xian)(xian)(xian)著降低了(le)OARSI評分(fen)，而AAV-CircSERPINE2-mut則提高了(le)OARSI評分(fen)；顯(xian)(xian)(xian)(xian)微CT圖像顯(xian)(xian)(xian)(xian)示OA兔(tu)骨(gu)贅增加(jia)，注(zhu)(zhu)射(she)AAV-CircSERPINE2后骨(gu)贅減(jian)少。免疫組化和(he)WB分(fen)析顯(xian)(xian)(xian)(xian)示，注(zhu)(zhu)射(she)AAV-CircSERPINE2-wt減(jian)輕(qing)兔(tu)OA模(mo)型軟骨(gu)基(ji)質的退行性變化，如(ru)細胞(bao)凋亡增強(qiang)和(he)分(fen)解(jie)代謝反應(ying)增強(qiang)，ECM組成增加(jia)。
骨關節炎 / 案例2
文章標題：IRF1 regulation of ZBP1 links mitochondrial DNA and chondrocyte damage in osteoarthritis
發表期(qi)刊：Cell Communication and Signaling (IF 8.2)
合作客戶：華中(zhong)科技(ji)大學(xue)同濟(ji)醫學(xue)院附屬同濟(ji)醫院祝文濤教授(shou)團隊
ZBP1對DMM小(xiao)鼠的OA進展至關重(zhong)要
為評(ping)估(gu)軟(ruan)骨(gu)(gu)(gu)細胞(bao)中ZBP1的(de)(de)(de)缺失是否能保護(hu)小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)免受(shou)OA侵害(hai)，研(yan)究團隊將(jiang)AAV9-shZBP1注(zhu)射(she)到小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)膝關節腔(qiang)內，IHC結果證實(shi)，與AAV9-shGFP組(zu)相(xiang)比，AAV9-shZBP1有效減少(shao)(shao)了ZBP1-軟(ruan)骨(gu)(gu)(gu)細胞(bao)數量。在首次注(zhu)射(she)AAV9兩周(zhou)后，進行DMM手術或假手術，并在術后第56天(tian)處死小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)。與DMM組(zu)相(xiang)比，AAV9-shZBP1組(zu)小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)關節軟(ruan)骨(gu)(gu)(gu)退(tui)化(hua)較(jiao)少(shao)(shao)，OARSI評(ping)分較(jiao)低。通過評(ping)估(gu)四組(zu)軟(ruan)骨(gu)(gu)(gu)下(xia)骨(gu)(gu)(gu)和(he)骨(gu)(gu)(gu)贅(zhui)的(de)(de)(de)變化(hua)，發現接受(shou)DMM手術的(de)(de)(de)AAV9-shZBP1注(zhu)射(she)小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)骨(gu)(gu)(gu)贅(zhui)形成減少(shao)(shao)，骨(gu)(gu)(gu)贅(zhui)評(ping)分降低。上(shang)述結果表(biao)明，軟(ruan)骨(gu)(gu)(gu)中ZBP1的(de)(de)(de)下(xia)調保護(hu)了小(xiao)(xiao)鼠(shu)(shu)免受(shou)DMM誘(you)導的(de)(de)(de)軟(ruan)骨(gu)(gu)(gu)退(tui)化(hua)和(he)骨(gu)(gu)(gu)贅(zhui)形成的(de)(de)(de)影響。
骨關節炎 / 案例3
文章標題：JNK-JUN-NCOA4 axis contributes to chondrocyte ferroptosis and aggravates osteoarthritis via ferritinophagy
發表期刊(kan)：Free Radical Biology and Medicine (IF 8.101)
合作客戶：華中科技大(da)學同濟醫學院附(fu)屬同濟醫院郭風勁教(jiao)授團隊
NCOA4過表達加劇小鼠創(chuang)傷后骨關節炎的軟骨退(tui)變
研究團(tuan)隊將AAV9-NCOA4注射到小鼠關(guan)節腔(qiang)中，實現(xian)NCOA4在軟(ruan)骨中的(de)(de)過表達。兩周后，對小鼠進行(xing)DMM手(shou)術或(huo)假(jia)手(shou)術。DMM手(shou)術小鼠發生(sheng)了軟(ruan)骨退(tui)變(bian)，表現(xian)為蛋白聚糖損(sun)失和軟(ruan)骨糜爛。值得注意的(de)(de)是，與DMM組相比，AAV9-NCOA4注射小鼠更(geng)(geng)容(rong)易發生(sheng)DMM引(yin)起的(de)(de)退(tui)變(bian)，其特點是OARSI評分更(geng)(geng)高。DMM手(shou)術后AAV9-NCOA4處理的(de)(de)小鼠出現(xian)了更(geng)(geng)大的(de)(de)骨贅(zhui)，骨贅(zhui)評分更(geng)(geng)高。以上結果表明，NCOA4在軟(ruan)骨中的(de)(de)過表達加速了創傷后骨關(guan)節炎小鼠的(de)(de)軟(ruan)骨退(tui)變(bian)和骨贅(zhui)的(de)(de)形成。
骨關節炎 / 案例4
文章標題：Comparative intra-articular gene transfer of seven adeno-associated virus serotypes reveals that AAV2 mediates the most efficient transduction to mouse arthritic chondrocytes
發表期(qi)刊：PLOS ONE (IF 2.9)
合作客戶：浙江中醫藥大學阮紅峰(feng)/吳承(cheng)亮/杜偉斌(bin)研究團隊
經關節內注射不(bu)同血清型AAV在軟骨組織中的(de)表(biao)達(da)
為比(bi)較七種常用的(de)AAV血(xue)清型（AAV 2、5、6、7、8、9和AAV-DJ）在體內對(dui)關(guan)(guan)(guan)節軟骨(gu)的(de)趨性(xing)和轉導效率，研究(jiu)團隊將等(deng)體積的(de)不(bu)同(tong)AAV血(xue)清類型注射(she)到小鼠(shu)膝(xi)關(guan)(guan)(guan)節腔內。檢測發現，eGFP在所有(you)注射(she)AAV的(de)小鼠(shu)的(de)關(guan)(guan)(guan)節軟骨(gu)、滑膜和半(ban)月板(ban)中都有(you)特異性(xing)表達(da)；與AAV5/6/7/8/9/DJ血(xue)清型相比(bi)，關(guan)(guan)(guan)節內注射(she)AAV2對(dui)小鼠(shu)膝(xi)關(guan)(guan)(guan)節軟骨(gu)組織感染效率更高(gao)且特異性(xing)更強。
五. 參考文獻
1. Evans CH, Ghivizzani SC, Robbins PD. Gene Delivery to Joints by Intra-Articular Injection. Hum Gene Ther. 2018 Jan;29(1):2-14.
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3. Kitase Y, Prideaux M. Targeting osteocytes vs osteoblasts. Bone. 2023 May;170:116724.
4. Yang YS, et al. Bone-targeting AAV-mediated silencing of Schnurri-3 prevents bone loss in osteoporosis. Nat Commun. 2019 Jul 4;10(1):2958.
5. Dong Suk Yoon,et al.Cellular and Tissue Selectivity of AAV Serotypes for Gene Delivery to Chondrocytes and Cartilage. Int. J. Med. Sci. 2021.Jul 25;18(15):3353-3360.
6. Shen S, et al. CircSERPINE2 protects against osteoarthritis by targeting miR-1271 and ETS-related gene. Ann Rheum Dis. 2019 Jun;78(6):826-836.
7. Sun K, et al. IRF1 regulation of ZBP1 links mitochondrial DNA and chondrocyte damage in osteoarthritis.Cell Communication and Signaling.2024. 22:366.
8. Sun K, et al. JNK-JUN-NCOA4 axis contributes to chondrocyte ferroptosis and aggravates osteoarthritis via ferritinophagy. Free Radic Biol Med. 2023 May 1;200:87-101.
9. Chen Q, et al. Comparative intra-articular gene transfer of seven adeno-associated virus serotypes reveals that AAV2 mediates the most efficient transduction to mouse arthritic chondrocytes. PLoS One. 2020 Dec 15;15(12):e0243359.
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