AAV在內耳的靶向應用策略（上）
耳(er)(er)聾是一(yi)種常(chang)見的(de)(de)(de)感官缺陷疾病(bing)之(zhi)一(yi)，位居我國各類殘疾之(zhi)首，其(qi)(qi)中(zhong)60%以(yi)(yi)上(shang)(shang)的(de)(de)(de)耳(er)(er)聾由遺(yi)傳因(yin)素引起(qi)，遺(yi)傳性(xing)耳(er)(er)聾在(zai)新生兒中(zhong)發生率約為(wei)(wei)1/500。目(mu)前臨床上(shang)(shang)對(dui)于遺(yi)傳性(xing)耳(er)(er)聾的(de)(de)(de)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)，主要(yao)是通過植入(ru)人工耳(er)(er)蝸、佩戴助聽器以(yi)(yi)及(ji)化學(xue)藥(yao)物(wu)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)，但這(zhe)(zhe)些都不能(neng)從根本上(shang)(shang)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)耳(er)(er)聾。近年(nian)來(lai)，基(ji)因(yin)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)藥(yao)物(wu)為(wei)(wei)常(chang)規方法(fa)無法(fa)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)的(de)(de)(de)疾病(bing)提供了(le)希(xi)望，截(jie)止2024年(nian)9月，全(quan)球(qiu)獲批上(shang)(shang)市的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)藥(yao)物(wu)共54款（不含(han)DNA和mRNA疫(yi)苗），以(yi)(yi)病(bing)毒為(wei)(wei)載體(ti)的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)療(liao)(liao)(liao)法(fa)就有16款。AAV載體(ti)憑借其(qi)(qi)高安全(quan)性(xing)，低免疫(yi)原(yuan)性(xing)等優(you)勢，可以(yi)(yi)安全(quan)地轉導中(zhong)樞(shu)神(shen)經系統(tong)和感官系統(tong)，并在(zai)多種疾病(bing)的(de)(de)(de)基(ji)因(yin)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)中(zhong)顯示出巨大潛力，這(zhe)(zhe)為(wei)(wei)遺(yi)傳性(xing)耳(er)(er)聾的(de)(de)(de)治(zhi)(zhi)愈(yu)帶來(lai)了(le)新的(de)(de)(de)希(xi)望。目(mu)前，已(yi)有多項研(yan)究(jiu)表明(ming)，使用AAV作為(wei)(wei)基(ji)因(yin)治(zhi)(zhi)療(liao)(liao)(liao)載體(ti)可以(yi)(yi)部分(fen)或(huo)完(wan)全(quan)恢復遺(yi)傳性(xing)耳(er)(er)聾小鼠模型的(de)(de)(de)聽力。
耳朵結構
耳(er)(er)(er)朵分為外耳(er)(er)(er)、中耳(er)(er)(er)和(he)內(nei)(nei)耳(er)(er)(er)三部分，其中外耳(er)(er)(er)和(he)中耳(er)(er)(er)傳導聲波(bo)，內(nei)(nei)耳(er)(er)(er)是聽覺(jue)和(he)位(wei)覺(jue)感受(shou)器。在結構上(shang)，外耳(er)(er)(er)包(bao)括(kuo)耳(er)(er)(er)廓和(he)外耳(er)(er)(er)道，中耳(er)(er)(er)由鼓膜(mo)、鼓室及聽骨鏈組成(cheng)，內(nei)(nei)耳(er)(er)(er)位(wei)于(yu)顳骨巖部內(nei)(nei)，包(bao)括(kuo)半規管、前庭和(he)耳(er)(er)(er)蝸（cochlea）。值得注意的(de)(de)是，大多數引起耳(er)(er)(er)聾的(de)(de)基因主要在耳(er)(er)(er)蝸內(nei)(nei)的(de)(de)細胞中表達，因此(ci)，AAV介(jie)導的(de)(de)針對(dui)聽力損失(shi)的(de)(de)基因療(liao)法一般(ban)都(dou)集中于(yu)靶(ba)向耳(er)(er)(er)蝸結構。
哺乳(ru)動(dong)物的(de)耳蝸(gua)(gua)內(nei)含有兩種類型的(de)毛(mao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)（Hair Cells, HCs）：內(nei)毛(mao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(IHCs)和外毛(mao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(OHCs)，這兩種毛(mao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)對(dui)聽(ting)覺信號(hao)的(de)檢測和處(chu)理至關(guan)重(zhong)(zhong)要(yao)，成熟的(de)哺乳(ru)動(dong)物毛(mao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)不(bu)能再生(sheng)，因此這些細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)一旦(dan)發生(sheng)損傷，其退化過程往(wang)往(wang)是不(bu)可逆(ni)的(de)。支持(chi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)(Supporting cells, SCs)圍繞在毛(mao)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)外周，對(dui)耳蝸(gua)(gua)內(nei)穩態十分重(zhong)(zhong)要(yao)，引(yin)起先(xian)天性(xing)耳聾的(de)GJB2基因即在支持(chi)細(xi)胞(bao)(bao)(bao)(bao)中表(biao)達。螺旋神經節神經元(yuan)（Spiral Ganglion Neurons, SGNs）是聽(ting)覺系統的(de)一級神經元(yuan)，在聽(ting)覺傳導過程中起重(zhong)(zhong)要(yao)作用。
此外(wai)，由(you)毛細胞(bao)、支持細胞(bao)及其它(ta)附屬結構構成了Corti器（柯蒂(di)氏器），Corti器周(zhou)圍是(shi)充滿外(wai)淋巴(ba)管的(de)前庭階(jie)（Scala vestibuli）、鼓階(jie)（Scala tympani）以及充滿內淋巴(ba)管的(de)蝸管（Scala media）。
圖1. 耳朵結構(gou)分(fen)析
（//www.audiocure.com/inner-ear-disorders/）
（Peters CW, et al. Trends Pharmacol Sci. 2021）
AAV靶向內耳策略
1、啟動子選擇
· 組成型啟動子
CMV和CBA已(yi)被證明可驅(qu)動(dong)耳蝸毛細(xi)胞(bao)(bao)、支(zhi)持細(xi)胞(bao)(bao)等(deng)多種細(xi)胞(bao)(bao)類型中的(de)轉基因表達(da)(da)，Pgk1（磷酸(suan)甘油(you)酸(suan)激酶1）啟動(dong)子(zi)則可驅(qu)動(dong)外源基因在支(zhi)持細(xi)胞(bao)(bao)中表達(da)(da)。
圖2. CMV、CBA和Pgk1啟動子驅動外(wai)源基(ji)因在離體培養小鼠耳蝸細胞中的表達
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
· 特異性啟動子
Syn1（突觸(chu)素1）啟動子可驅動外源基因(yin)在耳(er)蝸(gua)螺旋(xuan)神(shen)經節神(shen)經元中的(de)有效轉(zhuan)導，Myo7a（人肌(ji)球蛋白ⅦA）、Pou4f3（POU結構域第4類轉(zhuan)錄(lu)因(yin)子3）和Slc26a5（溶質載(zai)劑家族26成員5）是轉(zhuan)導毛細胞的(de)可選啟動子，使用時應考慮AAV的(de)包裝容量。
圖3. Syn1啟動子驅動外源基因在(zai)離體培養小鼠耳蝸耳蝸螺(luo)旋神經(jing)節神經(jing)元中(zhong)的表達(da)
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
2、注射方式選擇
應用于內耳(er)的注(zhu)射方(fang)式主(zhu)要有：圓窗膜（RWM）注(zhu)射、耳(er)蝸造口術（Cochleostomy）、后半規管(PSCC)注(zhu)射及胞囊(nang)（Utricle）注(zhu)射。
·圓窗(chuang)膜（RWM）注射(she)是新生小(xiao)鼠以及非人靈(ling)長類動物（NHPs）中常用的方法(fa)，載體(ti)可傳送至(zhi)耳蝸鼓(gu)階的外淋巴。該注(zhu)射方法(fa)對內耳外毛細胞轉導率相對有限。
·后半規管(PSCC)注(zhu)射能使病毒載體有效地感染(ran)新生(sheng)小鼠耳蝸和前庭器官的細(xi)胞(bao)。該(gai)方(fang)法同樣具有侵入性，可能會有損傷毛細(xi)胞(bao)的風險(xian)。
·耳蝸(gua)造口(kou)術(shu)（Cochleostomy）涉(she)及穿(chuan)透側壁，一般在成(cheng)(cheng)年受試者耳蝸(gua)骨鈣化后使(shi)用，載(zai)體可輸送至(zhi)蝸(gua)管的內淋(lin)巴。該(gai)方法(fa)具有(you)侵入性(xing)，可能會有(you)損傷毛細胞(bao)的風險，造成(cheng)(cheng)聽(ting)力(li)損害。
·胞囊(nang)注射可能會使載體(ti)傳(chuan)遞(di)至內淋巴，已被證明(ming)可在耳蝸中實現多(duo)種AAV血清型(xing)的(de)高水平表達(da)，研(yan)究表明(ming)在相同血清型(xing)、啟動子、病(bing)毒滴度及注射體(ti)積條件下，胞囊注射方法在新生小鼠(shu)內耳IHCs和OHCs中的(de)轉(zhuan)導率(lv)均(jun)略(lve)高于RWM注射法。
圖(tu)4. 耳蝸內的不同(tong)注(zhu)射途(tu)徑
（Maguire CA, et al. Hear Res. 2020）
下面介紹(shao)圓(yuan)窗膜(mo)（RWM）注射(she)、后半規管（PSCC）注射(she)和耳蝸造口術注射(she)方(fang)式的操作步驟：
1、圓窗膜（RWM）注射
1) 腹腔(qiang)注射氯胺(an)酮(100mg /kg)、甲苯噻嗪(qin)(10mg /kg)和乙(yi)酰丙嗪(qin)(2mg /kg)混(hun)合物麻醉小鼠(shu)，確保(bao)小鼠(shu)對疼痛刺激（如腳趾夾）無反(fan)應后，才能開始手(shou)術準備；
2) 在小鼠眼睛上(shang)涂抹保(bao)護性(xing)的藥膏，使其在麻醉期間保(bao)持眼睛濕潤，并(bing)抑制眨眼反射(she)；
3) 在整個過程中，將小鼠的頸部伸展(zhan)放在加熱墊上，直到小鼠完全清醒，以(yi)防止麻醉后體溫過低；
4) 用(yong)(yong)剃刀刮掉小鼠耳后的毛發，并用(yong)(yong)70%乙醇和聚(ju)維(wei)酮碘消毒(du)；
5) 在(zai)外耳下方做(zuo)一個(ge)切(qie)口，將軟(ruan)組織推開，露出(chu)鼓室大皰(pao)；
6) 用(yong)25G針在鼓室大皰(pao)上(shang)穿(chuan)孔，然后充分擴大以可(ke)見(jian)鐙骨動(dong)脈（SA）和圓窗膜(RWM)；
7) 用硼(peng)硅(gui)酸(suan)鹽毛細管移液(ye)(ye)管在(zai)RWM中心(xin)輕輕穿刺，觀察液(ye)(ye)體(ti)通過RWM的流(liu)出情況(耳蝸流(liu)出的液(ye)(ye)體(ti)用無菌(jun)濾紙干燥)；
8) 在(zai)射流穩定后(5-10 min)，將0.6~2μL的AAV載體通過RWM注射到耳蝸(gua)鼓階；
9) 拔(ba)出移液管后，用一(yi)小塊肌肉(rou)組織(zhi)迅速密封RW龕，并在肌肉(rou)上滴一(yi)小滴組織(zhi)膠固定，以避免耳蝸周圍淋巴液通過RWM滲漏(lou)；
10) 注(zhu)射完(wan)畢后，用脂(zhi)肪(fang)組(zu)織覆蓋大皰孔，將耳(er)后肌和脂(zhi)肪(fang)組(zu)織恢復正常位置(zhi)，用6-0或更小(xiao)的可吸收鉻線(xian)分層(ceng)縫合傷口，并作消(xiao)毒處(chu)理；
11) 把小鼠放在一個溫暖(nuan)干凈(jing)的籠子(zi)里觀察看護，待其完全恢復；
12) 術(shu)后(hou)(hou)皮下注(zhu)射卡洛芬（2 mg/kg）進行鎮痛，此后(hou)(hou)每(mei)24小時注(zhu)射一(yi)次，持(chi)續3天(tian)(tian)，以(yi)控制炎(yan)癥和疼痛。每(mei)天(tian)(tian)監測(ce)動(dong)物是否(fou)有痛苦、體(ti)重異常減(jian)輕(qing)、疼痛或(huo)感染(ran)的跡象。一(yi)般情況下，所有小鼠在手術(shu)后(hou)(hou)第三天(tian)(tian)應能正常活動(dong)。
圖(tu)5. 圓窗膜(mo)（RWM）注(zhu)射
（Akil O, et al.Methods Mol Biol. 2019）
2、后半規管（PSCC）注射
1) 通過腹腔注射氯(lv)胺(an)酮(100 mg/kg)和甲苯噻嗪(qin)(20 mg/kg)麻醉小(xiao)鼠；
2) 用(yong)剃(ti)刀刮掉小鼠左耳后(hou)的(de)毛發，并(bing)用(yong)10%聚維酮碘(dian)消毒；
3) 對耳后皮膚做一個15mm的(de)切口(kou)，解剖暴露面神經及(ji)胸鎖乳突肌(ji)后，切除近端部分肌(ji)肉；
4) 使用4-0 vicryl縫合(he)線將覆蓋顳骨(gu)(gu)的肌肉分離并向背(bei)側(ce)收(shou)回(hui)，露出后半規管的骨(gu)(gu)壁，清晰(xi)可見(jian)為(wei)一條深色(se)條紋；
5) 使用26號皮下注射針在后半(ban)規管(guan)附近扎一個小孔，等待(dai)5min，待(dai)外淋巴液滲(shen)漏(lou)減輕后，將(jiang)聚酰亞(ya)胺管(guan)的(de)尖端以(yi)貼(tie)近壺腹部的(de)方式插入(ru)后半(ban)規管(guan)中(zhong)；
6) 聚(ju)酰亞胺(an)管(guan)與小孔之間的縫隙用肌肉碎片和氰基丙烯酸酯膠(jiao)密封(feng)，通過(guo)無(wu)液體泄漏直觀評估密封(feng)的嚴密性；
7) 將250 nL的病毒懸液以100 nL/min的速度(du)在2.5 min內注入后半(ban)規管(guan)(guan)中，注射(she)后將試管(guan)(guan)留在后半(ban)規管(guan)(guan)中靜(jing)置5min；
8) 取出管子后，用小塊肌肉(rou)堵住小孔，并涂上氰基丙烯酸酯膠(jiao)水，最后用5-0尼龍縫合(he)線(xian)縫合(he)傷口；
9) 把小鼠放在一個溫(wen)暖干凈的籠子(zi)里，待(dai)其(qi)完全恢復。
圖6. 后半規管（PSCC）注射
（Suzuki J, et al. Sci Rep. 2017）
3、耳蝸造口術
1) 通(tong)過腹腔注射甲苯(ben)噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮（100mg/kg）麻醉小鼠；
2) 對(dui)小鼠右耳(er)后區域進行剃毛，并用10%聚維酮碘消(xiao)毒；
3) 在手術顯微鏡下，于(yu)耳(er)后做一個(ge)長(chang)約10 mm的切口，提取右側耳(er)廓(kuo)及胸鎖(suo)乳突(tu)肌，暴(bao)露位于(yu)顳(nie)骨邊緣的PSCC；
4) 用波恩微型(xing)探針在PSCC上鉆一個小(xiao)孔，等(deng)待幾(ji)分鐘，直到沒有明(ming)顯的外淋巴液流出(chu)；
5) 將聚酰亞胺管的尖端插(cha)入PSCC中，并使(shi)用組織(zhi)粘合(he)劑密封(feng)小孔(kong)，確保(bao)沒有外淋巴液流(liu)出；
6) 利(li)用MICRO4微量注(zhu)射控(kong)制器(qi)控(kong)制聚酰亞胺管進(jin)行病毒(du)注(zhu)射，速率179nL/min，每(mei)次(ci)注(zhu)射病毒(du)總體積(ji)為1 μL或2 μL，時間控(kong)制在(zai)5-10min；
7) 注(zhu)射后切斷聚酰亞胺管，留(liu)下約(yue)5mm與PSCC相連。用(yong)組織粘合(he)劑密封(feng)殘留(liu)的管孔，然(ran)后用(yong)5-0 Ethilon線縫合(he)皮膚；
8) 把(ba)小鼠放在一個溫暖干凈的籠(long)子里觀察看護，待其完全恢復。
以上是關于AAV在內(nei)耳應(ying)(ying)用(yong)中的啟(qi)動子和注射(she)方式(shi)的選擇策略，下期(qi)我們將繼續分(fen)享內(nei)耳應(ying)(ying)用(yong)中AAV血(xue)清型(xing)和載體的選擇，敬請期(qi)待~
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