AAV在內耳的靶向應用策略（下）
AAV載體(ti)憑(ping)借其高安全性，低免疫原性等(deng)優勢(shi)，可以安全地轉導中(zhong)樞(shu)神經系(xi)(xi)統(tong)和感(gan)官系(xi)(xi)統(tong)，并在多(duo)種疾病的(de)基(ji)因治(zhi)療中(zhong)顯(xian)示出巨大(da)潛力，這為遺傳性耳(er)聾的(de)治(zhi)愈帶(dai)來了(le)新的(de)希(xi)望。目前，已有多(duo)項研究(jiu)表明(ming)，使用AAV作為基(ji)因治(zhi)療載體(ti)可以部分或完(wan)全恢復遺傳性耳(er)聾小(xiao)鼠模型的(de)聽力。上期內(nei)容，我(wo)們分享了(le)關于AAV在內(nei)耳(er)應用中(zhong)的(de)啟動子和注射方式的(de)選擇策略：，本期(qi)我們將繼續分享內耳應用中AAV血清型(xing)、載體(ti)的選擇和優秀案例(li)。
一、AAV血清型選擇
1、新生小鼠
①傳統AAV血(xue)清(qing)型(xing)中，AAV1是(shi)新生(sheng)小鼠內耳基因(yin)傳遞使用(yong)最廣泛(fan)的血(xue)清(qing)型(xing)之(zhi)一(yi)，可(ke)轉導(dao)毛細胞(bao)、支持細胞(bao)、血(xue)管紋、前庭神(shen)經上皮多種細胞(bao)類型(xing)，并且通過(guo)圓窗(chuang)膜注射(she)方式可(ke)高效轉導(dao)內毛細胞(bao)。其(qi)它血(xue)清(qing)型(xing)AAV2、AAV6、AAV8、AAV9以不同的效率感染新生(sheng)小鼠耳蝸內毛細胞(bao)（圖1）。
圖1. 相(xiang)比其它天然AAV，AAV1在體外可(ke)高效轉(zhuan)導離(li)體培養的小鼠耳(er)蝸毛細(xi)胞
（Askew C, et al.Sci Transl Med.2015）
②與傳統的(de)AAV血清(qing)型相比，變(bian)體(ti)Anc80L65可介導靶(ba)基因在新生小鼠外毛細(xi)胞和內毛細(xi)胞中的(de)高效(xiao)穩定(ding)傳遞（圖(tu)2）。
圖2. 相比傳統AAV血清型，Anc80L65在體外可高效轉導小鼠耳蝸外毛細胞和內毛細胞
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
圖3. 相比傳統AAV血清型(xing)，Anc80L65在體內(nei)可(ke)高效轉導新生小鼠耳蝸內(nei)毛和外(wai)毛細胞(bao)
（Landegger LD, et al.Nat Biotechnol. 2017）
③經后半(ban)規管注射后，變體AAV2.7m8可在體內(nei)高(gao)(gao)效(xiao)轉導新生(sheng)小鼠外毛(mao)(mao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和內(nei)毛(mao)(mao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)，并且在外毛(mao)(mao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)轉導方面明顯優于Anc80L65（圖4）。此外，AAV2.7m8還能夠感染(ran)支持細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞群(內(nei)柱細(xi)(xi)胞(bao)(bao)和內(nei)指細(xi)(xi)胞(bao)(bao))(圖5），這些支持細(xi)(xi)胞(bao)(bao)亞群被認為能夠高(gao)(gao)效(xiao)促進毛(mao)(mao)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)再生(sheng)。
圖(tu)4. AAV2.7m8在(zai)體內高效感染(ran)新生小鼠耳蝸外(wai)毛細胞和內毛細胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
圖5. AAV2.7m8在體內高效感染新生小鼠內耳支(zhi)持細胞
（Isgrig K, et al. Nat Commun. 2019）
④經胞(bao)囊注(zhu)射(she)后，相比Anc80L65和(he)AAV2.7m8，AAV9-PHP.B在內毛細胞(bao)和(he)外毛細胞(bao)中(zhong)均具有強(qiang)的轉(zhuan)導效率，并在螺旋和(he)前庭神(shen)經節神(shen)經元中(zhong)顯(xian)著轉(zhuan)導。
圖6. AAV9-PHP.B在體內(nei)(nei)高效(xiao)感(gan)染新生(sheng)小鼠(shu)耳蝸(gua)外毛細胞和(he)內(nei)(nei)毛細胞
（Lee J, et al. Hear Res. 2020）
⑤通過RWM注射(she)，新(xin)型突變體AAV-ie-K558R可以強烈誘導(dao)新(xin)生小鼠耳(er)蝸中HC樣(yang)細胞的(de)再生
圖(tu)7. AAV-ie-K558R-Atoh1可在新生小鼠體內再生HC樣細胞
（Tao Y, et al.Signal Transduction and Targeted Therapy. 2022）
2、成年小鼠
在成年小(xiao)鼠中，相比于AAV1、AAV8、AAV9和(he)Anc80L65血清型，AAV2可同時高效轉導內毛細胞(bao)和(he)外毛細胞(bao)，其次是(shi)Anc80L65血清型（圖8）。
圖8. AAV2高(gao)效(xiao)轉(zhuan)導成年小鼠(shu)耳蝸(gua)毛(mao)細胞
（Omichi R, et al.Mol Ther Methods Clin Dev. 2020）
二、雙AAV載體選擇
AAV有限的(de)(de)(de)(de)包裝(zhuang)(zhuang)容(rong)量（約(yue)4.7kb）使其(qi)無法遞送一(yi)(yi)些(xie)較大(da)(da)的(de)(de)(de)(de)基因，這在一(yi)(yi)定程(cheng)度上(shang)限制了其(qi)疾病治療范圍，雙AAV（或三AAV）載(zai)(zai)體(ti)(ti)技(ji)術的(de)(de)(de)(de)發(fa)展解決了這一(yi)(yi)難題。雙AAV載(zai)(zai)體(ti)(ti)遞送策略即將(jiang)要遞送的(de)(de)(de)(de)大(da)(da)片段基因拆分(fen)并包裝(zhuang)(zhuang)到兩個(ge)AAV載(zai)(zai)體(ti)(ti)上(shang)，其(qi)中一(yi)(yi)個(ge)AAV載(zai)(zai)體(ti)(ti)攜帶啟(qi)動子元件和(he)(he)(he)5’端(duan)(duan)外(wai)源基因CDS，另外(wai)一(yi)(yi)個(ge)AAV載(zai)(zai)體(ti)(ti)攜帶3’端(duan)(duan)外(wai)源基因CDS和(he)(he)(he)polyA尾(wei)巴，載(zai)(zai)體(ti)(ti)兩端(duan)(duan)為ITR序列。將(jiang)這兩個(ge)AAV載(zai)(zai)體(ti)(ti)共感染目的(de)(de)(de)(de)細(xi)胞后，外(wai)源基因的(de)(de)(de)(de)上(shang)下游(you)部分(fen)根據AAV基因組(zu)的(de)(de)(de)(de)聚(ju)合(he)能力進(jin)行重組(zu)，最終產(chan)生(sheng)一(yi)(yi)個(ge)包含完整外(wai)源基因的(de)(de)(de)(de)mRNA轉錄(lu)本。目前常(chang)用的(de)(de)(de)(de)雙AAV載(zai)(zai)體(ti)(ti)策略有三種：overlapping、trans-splicing和(he)(he)(he)hybrid。
圖9. 雙(shuang)AAV載體策(ce)略示意(yi)圖
（Omar Akil. Hearing Research. 2020）
使用雙(shuang)AAV載體遞(di)送技術，可(ke)以(yi)將超過4 kb的編(bian)碼序(xu)列轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)導(dao)到內耳(er)，這為(wei)一系列由較大基因(yin)引起的遺傳性耳(er)聾(long)的基因(yin)治療開辟了(le)(le)可(ke)能性。例如，研究人(ren)員利用雙(shuang)AAV載體方法在(zai)(zai)DFNB9耳(er)聾(long)小(xiao)鼠(shu)模型(xing)中成功(gong)實(shi)現了(le)(le)Otof基因(yin)cDNA編(bian)碼序(xu)列（～6 kb）的完整表(biao)達(da)，實(shi)現轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)導(dao)細(xi)胞(bao)中Otof基因(yin)表(biao)達(da)的持久恢復和耳(er)聾(long)表(biao)型(xing)的逆轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)，而(er)且(qie)該治療方法不僅可(ke)以(yi)在(zai)(zai)聽力發(fa)作前預防Otof-/-小(xiao)鼠(shu)的耳(er)聾(long)，而(er)且(qie)在(zai)(zai)聽力發(fa)作后給藥(yao)還可(ke)以(yi)持續逆轉(zhuan)(zhuan)(zhuan)耳(er)聾(long)表(biao)型(xing)，這為(wei)未來在(zai)(zai)DFNB9患者中進行(xing)基因(yin)治療試驗帶來了(le)(le)希望。
圖(tu)10. 雙AAV載(zai)體恢(hui)復P10 Otof - /- 小鼠otoferlin表(biao)達并預防耳聾
（Akil O, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2019）
· 小結(jie) ·
不同的(de)啟動子、注射(she)方(fang)式(shi)、血清型、病毒用量(liang)及載體(ti)遞送(song)形式(shi)等因(yin)素均會(hui)影響(xiang)AAV在內耳的(de)基因(yin)遞送(song)效(xiao)率，因(yin)此以上數據僅供參考，建議您在具體(ti)實驗(yan)之前查閱相關文獻或技(ji)術資料(liao)，選(xuan)擇合適的(de)策略開展實驗(yan)。
三、優秀案例分享
文章題目(mu)：Template-independent genome editing in the Pcdh15av-3j mouse, a model of human DFNB23 nonsyndromic deafness
合作客戶：北京(jing)腦(nao)科學與類腦(nao)研究中心熊巍(wei)教(jiao)授課題組
發表(biao)期刊：Cell Reports（IF9.995）
維真生物AAV2/9病(bing)毒感(gan)染耳蝸毛細胞效果圖(tu)
參考來源
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