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神經遞質探針

1. 研究背景

2. 開發&原理

3. 探針特征（已發表）

4. 探針資源

5. 探針載體獲取

6. 探針病毒使用

7. 常見問題解答

8. 參考文獻

1.研究背景

人類大腦約有860億個神經元，這些神經元由數萬億個突觸連接在一起。神經元的主要功能是接收、整合和傳遞信息。它們通過電化學信號進行交流，并形成神經網絡，從而控制動物的認知和行為。

神經科學研究的重點，就是從細胞和分子水平了解神經元如何相互連接和交流，這對于解析動物認知和行為背后的神經環路具有重大意義。興奮是神經系統信息傳遞的方式，神經纖維受到刺激后，膜內外電位會產生一系列變化而產生興奮，興奮產生后先在同一個神經元上以動作電位的形式傳導，興奮跨過突觸間隙時通過電化學信號的轉變，再傳遞到下一個神經元。

突觸處有兩種類型的化學信使，神經遞質和神經調質。神經遞質通過突觸間隙擴散，特異地作用于突觸后細胞上的受體，從而完成信息傳遞功能。而神經調質則與突觸后細胞上的受體結合后，增強或削弱遞質的效應，從而調節突觸信息傳遞。例如，谷氨酸和γ-氨基丁酸等神經遞質結合突觸后細胞上的受體后，可以迅速地使突觸后神經元去極化或超極化，進而直接調控這些神經元的活動。對于神經調質，它們大多與GPCRs結合后誘發突觸前或突觸后電位，不直接引起突觸后生物學效應，但能調節遞質在突觸前的釋放及突觸后細胞的興奮性，調節突觸后細胞對遞質的反應。

操控和檢測神經元之間的交流是神經科學研究的主要手段，許多遺傳工具已經被開發出來，這些遺傳工具通過腺相關病毒(AAV)等病毒載體用于神經環路的操控和成像。目前，和工具被用來直接操控突觸前神經元動作電位的產生，用于檢測突觸后神經元內的信號傳遞。然而，高靈敏度、高特異性和高時空分辨率的神經遞質和神經調質檢測技術還不成熟。

傳統的神經遞質檢測技術，主要是通過微透析對腦脊液進行采樣并生化監測、通過碳纖電極進行記錄，這些檢測手段各自存在諸多弊端，例如特異性差、靈敏度低和時空分辨率差，難以精確反映神經遞質的真實動態信息等。為了解決這一系列的問題，眾多神經科學家一直在致力于優化已有的方法或者開發新的技術，以求彌補短板，取得突破。

2.開發&原理

自2018年起，北京大學李毓龍教授課題組通過偶聯GPCR和循環重排熒光蛋白cpFP開發出了很多檢測神經遞質的可遺傳編碼的熒光探針。神經遞質與GPCR的結合會引起后者構象的改變，而這種變化又會引起cpFP發生構象改變，進而影響其發色團周圍的微環境，最終導致其熒光強度的改變，這種熒光變化可以通過熒光顯微鏡檢測到(Fig 1a和1b)。這些可遺傳編碼的熒光探針被命名為GRAB(GPCR Activation-Based)探針，用于以較高的時空分辨率在體檢測神經遞質的動態變化。


Fig1a：綠色神經遞質探針（cpEGFP-based）的工作原理	Fig1b：紅色神經遞質探針（cpmApple-based）的工作原理

3.探針特征（已發表）

探針名稱	所檢測神經化學物質	版本	顏色	骨架	親和力	信號響應幅度	動力學	下游信號偶聯	參考文獻
Ach2.0	乙酰膽堿	第一代	綠色	人M3受體	EC50~1uM	ΔF/F0~90%	τon~200ms, τoff~800ms	弱偶聯	[8]
Ach3.0	乙酰膽堿	第二代	綠色	人M3受體	EC50~2uM	ΔF/F0~280%	τon~112ms, τoff~580ms	幾乎不偶聯	[3]
Ach3.0-mut	乙酰膽堿	第二代對照	綠色	人M3受體	EC50~0uM （W200A突變）	ΔF/F0~1.8%	-	-	[3]
DA1m	多巴胺	第一代	綠色	人D2受體	EC50~130nM 中等親和力	ΔF/F0~90%	τon~60ms, τoff~700ms	幾乎不偶聯	[7]
DA1h	多巴胺	第一代	綠色	人D2受體	EC50~10nM 高親和力	ΔF/F0~90%	τon~140ms, τoff~2500ms	幾乎不偶聯	[7]
DAmut(1st)	多巴胺	第一代對照	綠色	人D2受體	EC50~0uM C118A和S193N突變	無效應	-	-	[7]
DA2m(DA4.4)	多巴胺	第二代	綠色	人D2受體	EC50~90nM 中等親和力	ΔF/F0~340%	τon~40ms, τoff~1300ms	非常小的偶聯	[2]
DA2h(DA4.3)	多巴胺	第二代	綠色	人D2受體	EC50~7nM 高親和力	ΔF/F0~280%	τon~50ms, τoff~7300ms	非常小的偶聯	[2]
DAmut(2nd)	多巴胺	第二代對照	綠色	人D2受體	EC50~0uM C118^3.36A和S193^5.42N突變	無效應	-	-	[2]
rDA1m (rDA2.5m)	多巴胺	-	紅色	人D2受體	EC50~95nM 中等親和力	ΔF/F0~150%	τon~80ms, τoff~770ms	非常小的偶聯	[2]
rDA1h (rDA2.5h)	多巴胺	-	紅色	人D2受體	EC50~4nM 中等親和力	ΔF/F0~100%	τon~60ms, τoff~2150ms	非常小的偶聯	[2]
rDAmut (rDA2.5mut)	多巴胺	對照	紅色	人D2受體	EC50~0uM C118^3.36A和S193^5.42N突變	無效應	-	-	[2]
NE1m(NE2.1)	去甲腎上腺素	-	綠色	人a2A受體	EC50~930nM 中等親和力	ΔF/F0~230%	τon ~70ms, τoff~ 750ms	不偶聯	[6]
NE1h(NE2.2)	去甲腎上腺素	-	綠色	人a2A受體	EC50~83nM 高親和力	ΔF/F0~130%	τon ~30ms, τoff~ 2000ms	不偶聯	[6]
NEmut	去甲腎上腺素	對照	綠色	人a2A受體	EC50~0uM S5.46A突變	無效應	-	-	[6]
Ado1.0	腺苷	-	綠色	人A_2A受體	EC50~60nM	ΔF/F0~130%	τon~36ms, τoff~1890ms	幾乎不偶聯	[4]
Ado1.0mut	腺苷	對照	綠色	人A_2A受體	EC50~0uM F168A突變	無效應	-	-	[4]
5-HT1.0	五羥色胺	-	綠色	人5-HT2C 受體	EC50~22nM	ΔF/F0~250%	τon~0.2s, τoff~3.1s	不偶聯	[1]
5-HTmut	五羥色胺	對照	綠色	人5-HT2C 受體	EC50~0uM D134^3.32Q突變	無效應	-	-	[1]

4.探針資源

在李教授組的授權下，山東維真生物可以出售這些探針的病毒產品（AAV產品為主），以幫助神經科學工作者在體內檢測乙酰膽堿(ACh)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺(5-HT)、組胺(HA)、腺苷(Ado)、腺苷三磷酸(ATP)、血管活性腸肽(VIP)、膽囊收縮素(CCK)、神經肽Y(NPY)、促腎上腺皮質激素釋放因子(CRF)、精氨酸血管加壓素(AVP)、催產素(OXT)、生長激素抑制素(SST)、神經降壓肽(NTS)、內源性大麻素(eCB)、大麻素(AEA)和褪黑素(MT)等各種遞質的動態變化，歡迎大家點擊“AAV工具” 中的“神經遞質探針”進行選購！！！

5.探針載體獲取

以上所述所有GRAB探針均由北京大學李毓龍組研發或聯合開發。部分探針已經發表，部分探針尚未發表。李毓龍組不僅開發了這些探針，還開發了這些探針的Cre依賴和突變版本，包括紅色和綠色的熒光信號，以滿足神經科學工作者多樣化的實驗需求。此外，為了提升探針的性能，這些探針還在持續優化中，不斷更新迭代。

以上探針均由維真生物協助提供。其中已發表的探針（產品編號中含PUB的病毒為文章中所用病毒），維真生物均有現貨，當天上午下單，下午/次日即可發貨；若由于產品脫銷無庫存，1-2周即可完成入庫并發貨；您可以通過公司技術熱線400-077-2566訂購。

如若您對未發表的探針或者探針序列感興趣，您也可通過上述方式與我們聯系，,我們將在第一時間幫您與李教授組溝通，征得李教授組的同意之后，我們也可以出售給您。

6.探針病毒使用

由于血腦屏障的存在，普通的注射方式很難實現病毒在腦區較高且特異性的表達，因此研究者通常需要借助腦立體定位儀將探針病毒注射至特定腦區（詳見Fig 2），以感染全腦和局部腦區。

Fig2：腦立體定位注射的示意圖
(Van der Perren, A., et al, V. J. Vis. Exp. (108), e53670, doi:10.3791/53670 (2016)

腦立體定位注射的詳細步驟如下：

1. 實驗動物稱重，進行麻醉；

2. 待實驗動物完全麻醉后，用剃毛器將動物頭頂眼睛至耳朵之間的毛發剃除干凈；

3. 將麻醉后的實驗動物固定于腦立體定位儀上，具體操作為：實驗動物眼部涂抹青霉素眼藥膏以保護其雙眼；將門齒掛在門齒掛鉤上，確保頭部保持固定；檢查左右耳桿是否在同一水平上，將左右耳桿通過外耳道插入實驗動物耳內。實驗動物固定好的標準為：鼻對正中，頭部不動，提尾不掉，目測大腦放置水平；

4. 手術：用碘伏對實驗動物頭皮進行消毒清理，用手術刀沿中間位置剪開頭皮，用鑷子對表面的結締組織進行清理，暴露實驗動物的顱骨表面；然后進行調平，首先找到前囟這個坐標，并將其歸零，然后向左右調平，使左右兩側處于同一水平，調整前后囟，使前后囟也在同一水平。

5.病毒注射：通過查詢實驗動物的腦立體定位圖譜確定待注射腦區的位置（Fig 3a和3b是大鼠和小鼠的腦譜），并確定其坐標值，即ML值（X軸）、AP值（Y軸）、DV值（Z軸）；根據目標腦區設定好坐標，移開注射針，用顱骨鉆開窗（由于顱骨薄，故務必注意顱骨鉆的力度！！），操作時避免傷及腦組織；微量注射器吸取病毒液，隨后固定在定位儀上，根據設好的坐標進行病毒注射，注射速度控制在0.1-0.15μl/min，注射劑量視具體實驗而定。注射完畢，留針10min，以便病毒液充分吸收，然后慢慢回針。


Fig3a：The Rat Brain	Fig3b：The Mice Brain

6. 縫合頭皮并消毒, 完成腦定位注射; 將動物從腦立體定位儀取下, 回籠待蘇醒; 動物蘇醒后, 正常喂養, 病毒注射后2-4周可檢測轉基因的表達。

7.常見問題解答

7.1 使用探針AAV病毒注射時，我該使用多大的病毒量？
考慮到病毒批次間的差異，我們建議您直接注射未稀釋的病毒原液200-400nl/site。

7.2 神經遞質探針在大鼠中是否能像在小鼠中一樣表達得很好？
神經遞質探針在大鼠中也可以很好地工作。根據李教授組已發表的論文，這些探針可以用在多種有機體中，包括果蠅、斑馬魚、老鼠和斑馬雀等。

7.3 你們是否也有廣譜啟動子或其他組織特異性啟動子的探針AAV病毒？
有些探針在開發時已構建了廣譜啟動子或其他組織特異性啟動子的載體，如CAG，EFs，EF1α，CamKIIα，GfaABC1D和TRE等，具體可以參考探針資源部分的表2。當然，如果您對其他組織特異性啟動子感興趣，請參考我們的組織特異性啟動子列表（見下表）來選擇您感興趣的啟動子。如果您找不到想用的啟動子，可以聯系我們。

組織	啟動子名稱	啟動子大小	啟動子來源	啟動子描述	啟動子應用
神經	hSyn	471bp	人源	突觸蛋白1啟動子	神經元特異性啟動子
	CamKIIa	1.2kb	小鼠	鈣/鈣調蛋白依賴性蛋白激酶II α啟動子	大腦新皮質和海馬興奮性神經元特異性啟動子
	c-fos	1.7kb	小鼠	c-fos基因啟動子	興奮性神經元啟動子
	Mecp2	230bp	小鼠	甲基 CpG 結合蛋白 2啟動子	短的神經元特異性啟動子
	NSE	1.3kb	小鼠	烯醇化酶啟動子	神經元特異性啟動子
	Somatostat(SST)	1.2kb	人源	生長抑制素I基因的啟動子	gamma氨基丁酸能抑制性神經元SST亞型特異性啟動子
	TH	2.5kb	大鼠	酪氨酸羥化酶基因啟動子	多巴胺能神經元特異性啟動子
	GFAP	2.0kb	人源	膠質纖維酸性蛋白啟動子	星形膠質細胞特異性啟動子
	GFAP104	845bp	人源	EF1a和GFAP的嵌合型啟動子	星形膠質細胞特異性啟動子
	GfaABC1D(truncated GFAP)	681bp	人源	膠質纖維酸性蛋白啟動子	星形膠質細胞特異性啟動子
	ALDH1L1	1.3kb	人源	醛脫氫酶1家族成員L1啟動子	丘腦中星形膠質細胞特異性啟動子
	MBP	1.3kb	人源	髓磷脂堿性蛋白啟動子	少突膠質細胞特異性啟動子
肝臟	ALB	2.4kb	小鼠	白蛋白啟動子	肝臟特異性啟動子
	TBG	460bp	人源	甲狀腺素結合球蛋白啟動子	肝臟特異性啟動子
	ApoEHCR-hAAT	1.3kb	人源	載脂蛋白E的肝細胞控制區和人α1抗胰蛋白酶啟動子的嵌合啟動子	肝臟特異性啟動子
心臟	aMHC	0.4kb	小鼠	肌球蛋白重鏈α啟動子	心臟特異性啟動子
心臟	cTNT+intron	0.7kb	雞	心肌肌鈣蛋白T啟動子	心肌特異性啟動子
眼睛	Rep65	0.7kb	小鼠	視網膜色素上皮65啟動子	視網膜色素上皮細胞特異性啟動子
眼睛	VMD2 promoter	0.65bp	人源	卵黃形成黃斑性營養不良2基因啟動子	視網膜色素上皮細胞特異性啟動子
胰腺	Insulin	0.85kb	小鼠	胰島素基因啟動子	胰腺β細胞特異性啟動子
胰腺	PDX1	2.7kb	小鼠	胰十二指腸同源盒1啟動子	胰腺β細胞特異性啟動子
血管	SM22a	0.45kb	小鼠	SM22α啟動子	血管平滑肌特異性啟動子
	ICAM2	0.15kb	人源	細胞間粘附分子2啟動子	血管內皮特異性啟動子
	CD68	0.7kb	人源	CD68分子啟動子	單核巨噬細胞特異性啟動子
	F4/80	1.2kb	小鼠	F4/80基因promoter	巨噬細胞特異性啟動子
肌肉	MCK	1.3kb	小鼠	肌酸激酶基因啟動子	肌肉細胞特異性啟動子
肌肉	3×enhancer McK	728bp	小鼠	修改的肌酸激酶基因啟動子	肌肉細胞特異性啟動子
腎臟	NPHS1	1.2kb	小鼠	Nephrin 1基因啟動子	腎臟特異性啟動子

7.4 你們探針AAV病毒的最小規格是多少？
我們的探針AAV病毒是按照50μl/支的規格進行分裝的，因此出售的最小規格是50μl。

7.5 AAV血清型很多，你們有其他血清型的探針AAV病毒嗎，比如逆行AAV血清型？
對于大多數神經遞質探針，我們通常將其包裝成AAV9血清型，目前還沒有嘗試逆行AAV血清型。如果您需要逆行血清型，我們也可以幫您包裝。目前我們可以為您包裝AAV1，AAV2， AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAVrh10，AAV retro，AAV ANC80，AAV DJ & AAV DJ-8，AAV PhpB & AAV PhpeB，AAV 7m8和AAV shh10等血清型。

8.參考文獻

8.1 Wan, J., et al. (2021). "A genetically encoded sensor for measuring serotonin dynamics." Nat Neurosci.

8.2 Sun, F., et al. (2020). "Next-generation GRAB sensors for monitoring dopaminergic activity in vivo." Nat Methods 17(11): 1156-1166.

8.3 Jing, M., et al. (2020). "An optimized acetylcholine sensor for monitoring in vivo cholinergic activity." Nat Methods 17(11): 1139-1146.

8.4 Peng, W., et al. (2020). "Regulation of sleep homeostasis mediator adenosine by basal forebrain glutamatergic neurons." Science 369(6508).

8.5 Jing, M., et al. (2019). "G-protein-coupled receptor-based sensors for imaging neurochemicals with high sensitivity and specificity." J Neurochem 151(3): 279-288.

8.6 Feng, J., et al. (2019). "A Genetically Encoded Fluorescent Sensor for Rapid and Specific In Vivo Detection of Norepinephrine." Neuron 102(4): 745-761 e748.

8.7 Sun, F., et al. (2018). "A Genetically Encoded Fluorescent Sensor Enables Rapid and Specific Detection of Dopamine in Flies, Fish, and Mice." Cell 174(2): 481-496 e419.

8.8 Jing, M., et al. (2018). "A genetically encoded fluorescent acetylcholine indicator for in vitro and in vivo studies." Nat Biotechnol 36(8): 726-737.

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