鈣成像技術

 神經元的活動是大腦復雜行為表現的基礎。而神經元的活動會引起細胞內游離鈣濃度的快速變化。鈣離子作為一類重要的胞內信號分子，在神經元功能中起著重要的作用，如突觸囊泡中神經遞質的釋放等。鈣成像技術可以直接測量神經元和神經元組織中動態的鈣流動，從而達到檢測神經元活動的目的。

1、鈣成像原理：利用特殊的熒光染料或鈣離子指示劑，將神經元中鈣離子濃度的變化通過熒光強度表現出來，通過對鈣離子變化的快速成像，反映神經元的活性變化。

2、鈣離子指示劑（Calcium Indicators）

 對鈣離子的功能研究，鈣指示劑是必不可少的工具。根據熒光光譜、鈣離子親和力及其化學特性的不同大致可分為化學指示劑和遺傳編碼指示劑兩大類。

化學指示劑是檢測細胞質中鈣離子濃度的傳統工具，主要是一些能特異性與鈣離子結合的小分子，包括Fura-2、indo-1、fluo-3、fluo-4、Calcium Green-1等，這些小分子都是被稱作BAPTA的鈣離子螯合劑，是乙二醇雙四乙酸（EGTA）的一種同系物，對Ca2+具有較高的選擇性。化學熒光指示劑通常采用電極刺穿或借助乙酰氧基甲酯和右旋葡萄糖的方式進入到目標部位。

遺傳編碼鈣離子指示劑（genetically encoded calcium indicators，GECIs），是隨著基因工程技術的發展，出現的一種新型的鈣離子指示劑，它可以實現在體實驗中對鈣離子的長時程檢測和實時動態檢測，并且還可以借助細胞器的特異性定位信號表征某些特定的亞細胞結構的鈣離子變化情況。

 根據發光原理可將GECIs分為兩大類，以單個熒光蛋白為基礎的GECIs和由熒光共振能量轉移（FRET）的熒光蛋白對構成的GECIs。前者主要包括Pericams、GCaMP和Camgaroos，后者主要包括TN-XXL、Cameleons、D3cpV等。GECIs類鈣指示劑則主要借助于病毒感染的方式導入至目標部位。

遺傳編碼鈣離子指示劑
 （Jihae Oh et al. Korean J Physiol Pharmacol. 2019）

3、GCaMPs鈣指示劑

 在GECIs中，以結構導向設計的GCaMP應用最為廣泛。GCaMPs是單個綠色熒光蛋白GFP、鈣調蛋白CaM和平滑肌細胞肌球蛋白輕鏈激酶片段M13融合的產物。在Ca2+存在的情況下，CaM會和M13結合，大大增加熒光的強度。其結構示意圖和成像原理如下圖所示。

4、鈣成像研究步驟

下面以遺傳編碼類鈣離子指示劑為例，簡述研究步驟：
第一步：選取合適的GECIs類鈣離子指示劑；
第二步：通過病毒感染的方式將鈣離子指示劑導入目標位置；
第三步：記錄鈣離子的動態變化，分析神經元活動。

5、如何選擇合適的鈣指示劑(以GCaMPs為例)

 自2001年GCaMP1問世以來，科學家們通過基于結構的突變和基于神經元的篩選方法不斷優化GCaMP的親和性、信噪比、動力學和動態范圍等，先后成功開發過GCaMP2,GCaMP3,GCaMP5、GCaMP6和jGCaMP7，以滿足研究者不同的成像實驗。那么，面對眾多的GCaMPs鈣指示劑，我們該如何選擇呢？眾所周知，不同的成像實驗需要使用不同性質的GCaMP，如本底熒光低的GCaMP適用于寬視場成像技術，可以同時檢測大量神經元的活動，這主要是由于大量神經元被GCaMP標記，光子數多，容易形成比較強的背景熒光；本底熒光高的適用于檢測神經亞細胞的信號，如樹突棘和軸突，這主要是由于這些神經亞細胞結構體積小，GCaMP表達少，光子數少，背景熒光低甚至可以被忽略；快動力學的GCaMP適合檢測神經元放電模式的動態變化；慢動力學的GCaMP則適合檢測所有活動的神經元。下表是GCaMP6和jGCaMP7系列探針的特點：

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8、參考文獻：

1. Imaging and analysis of genetically encoded calcium indicators linking neural circuits and behaviors；
2. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity；
 3. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.