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質 粒 抽 提
質粒提(ti)取目的
質粒是(shi)攜帶外源基因進入(ru)細(xi)菌中(zhong)擴(kuo)增或者表達的重要(yao)媒介，這種基因運載(zai)工具(ju)在基因工程(cheng)中(zhong)具(ju)有極廣(guang)泛的應用價(jia)值，要(yao)想從細(xi)菌中獲得質粒DNA,需要通(tong)過質粒提取的方法。
質粒提取的幾(ji)種方法及原理
質粒提取(qu)主要有堿裂解法(fa)，煮(zhu)沸裂解法(fa)，小量一(yi)步提取(qu)法(fa)等。
1、堿裂解法原理：根據共價閉合環狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結構被破壞而發生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環狀質粒DNA也會發生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環狀質粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
2、煮沸法裂解：將細菌懸浮于含Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質和染色體DNA變性。但是，閉環質粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構，當溫度下降后，閉環DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。
煮(zhu)沸裂解(jie)法對于小(xiao)于15kb的(de)小(xiao)質粒很有效(xiao)，可(ke)用于提取步(bu)至lmL（小(xiao)量(liang)制備），多至250mL（大(da)量(liang)制備）菌(jun)液的(de)質粒，并且對大(da)多數的(de)大(da)腸桿菌(jun)菌(jun)株都適(shi)用。
3、小量一步提取法：由于細菌染色體DNA比質粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發生變性。同樣受機械力質粒DNA會變性，機械力消失后復性。但質粒DNA的復性快，仍溶于溶液而細菌染色體DNA復性較慢，會形成不溶的網狀結構，通過高速離心可以分離得到質粒DNA 。
質(zhi)粒(li)提取方法(fa)選擇
質粒提取的方法(fa)主要(yao)根據(ju)質粒DNA分子(zi)量的大小(xiao)，所(suo)用細菌的種屬，細菌裂解(jie)釋放(fang)DNA后的純化方法(fa)和(he)實(shi)驗要(yao)求(qiu)來選擇(ze)。
1、質(zhi)(zhi)粒DNA的(de)分子大于(yu)15kb時，在質(zhi)(zhi)粒抽提過程中(zhong)容易受損，可(ke)以采用比較溫和(he)的(de)裂(lie)解方(fang)法(fa)，將(jiang)細菌懸浮于(yu)等滲的(de)葡(pu)萄(tao)糖溶液中(zhong)，加入(ru)溶菌酶和(he)EDTA破(po)壞細胞壁和(he)細胞膜，這樣(yang)可(ke)以緩解高(gao)滲透壓的(de)細菌在釋放質(zhi)(zhi)粒DNA時的(de)壓力(li)，保護質(zhi)(zhi)粒DNA。
2、小(xiao)分(fen)子的質粒DNA可以選用相對劇烈的方法(fa)來(lai)分(fen)離DNA。可以用煮(zhu)沸法(fa)，堿裂(lie)解法(fa)或者加入溶(rong)菌酶(mei)，EDTA和去垢劑裂(lie)解細菌。這些方法(fa)會使DNA變性，但兩條互補鏈(lian)仍會互相盤繞，并(bing)緊密的結合在(zai)一起，在(zai)恢復正常條件后，DNA便會復性。
3、對于那(nei)些(xie)經變性劑、溶(rong)菌酶及加熱處理后能釋放大(da)量碳水化合物的大(da)腸桿(gan)菌菌株，則(ze)不(bu)推薦(jian)使用煮(zhu)沸(fei)法。而這(zhe)(zhe)些(xie)碳水化合物在密度梯度中會緊靠超螺旋(xuan)的DNA分(fen)子形成致密模糊的區帶，因此很難避(bi)免，而這(zhe)(zhe)些(xie)碳水化合物可抑(yi)制多種限制酶的活性。這(zhe)(zhe)類菌株制備質(zhi)粒(li)時，不(bu)宜采用煮(zhu)沸(fei)法。
4、菌株含有限制性(xing)核酸內切(qie)酶(mei)A的不(bu)宜(yi)使(shi)用(yong)煮沸(fei)法。因為(wei)煮沸(fei)不(bu)能使(shi)內切(qie)酶(mei)A完全失(shi)活(huo)，在后續實驗(yan)中再(zai)用(yong)限制性(xing)內切(qie)酶(mei)消化時，質粒(li)DNA會被降解(jie)。此時必須用(yong)酚：氯仿進行抽提。
煮(zhu)沸法時間(jian)短，（特點(dian)） 操作簡單，時間(jian)短；（缺(que)點(dian)）條(tiao)件(jian)過于劇(ju)烈，易造成質粒斷裂(lie)，回收率較(jiao)低。
堿裂解(jie)法操作簡單，（特點(dian)） 所得質(zhi)粒量較多且污染(ran)少，（缺點(dian)）花費的時(shi)間較長。
質(zhi)粒提(ti)取試劑(ji)盒選擇
1、小提質粒：（特點）簡單快速，可高通量提取 ；（濃度）100-200ng/ul；（用途）測序，PCR，腺病毒包裝、多數細胞轉染實驗
2、中提質粒：（特點）質粒DNA量較高，（濃度）0.7-1ug/ul；（用途）測序，多數細胞轉染實驗
3、大提質粒：（特點）質粒DNA量非常高，雜質少，無內毒素（濃度）0.5-2ug/ul （用途）慢病毒、腺相關病毒包裝，多數細胞轉染或其他需要大量質粒的實驗
大多數試(shi)劑(ji)盒都是(shi)在堿裂解法(fa)的(de)(de)基礎上優化改進(jin)的(de)(de)。
常(chang)用(yong)的質粒(li)提(ti)取試劑盒有：OMEGA，BIOMIGA，Sigma，TaKaRa,promega,天根，康為(wei)世紀，生(sheng)工(gong)等。
質粒(li)抽提(ti)按得(de)到(dao)質粒(li)DNA的(de)量可分為小提(ti)，中(zhong)提(ti)，大提(ti)。
質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)小提用(yong)(yong)的(de)菌液(ye)量(liang)(liang)很少(shao)，一(yi)般(ban)1-5ml，提出(chu)的(de)質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)DNA量(liang)(liang)較少(shao)，其特點是簡便、快速，能同(tong)時處(chu)理大量(liang)(liang)試(shi)樣(yang)，所得DNA有一(yi)定純(chun)度(du)，此(ci)質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)DNA可直(zhi)接用(yong)(yong)于DNA序列(lie)分(fen)析(xi)，各種酶促反應，PCR以及(ji)部(bu)(bu)分(fen)細胞系的(de)轉染等對(dui)質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)濃(nong)度(du)要求不高的(de)實驗(yan)。維真(zhen)生物(wu)采(cai)用(yong)(yong)高通量(liang)(liang)小提試(shi)劑盒，從1ml菌液(ye)中提取質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)，用(yong)(yong)90ul洗(xi)脫液(ye)洗(xi)脫得到的(de)質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)濃(nong)度(du)為(wei)100-200ng/ul，可以滿(man)足大部(bu)(bu)分(fen)實驗(yan)要求，也(ye)可以直(zhi)接用(yong)(yong)于一(yi)般(ban)的(de)腺(xian)病(bing)毒包裝(zhuang)，不過(guo)維真(zhen)生物(wu)慢病(bing)毒、腺(xian)相(xiang)關病(bing)毒（AAV）包裝(zhuang)一(yi)般(ban)使用(yong)(yong)大提試(shi)劑盒進行抽提，以保(bao)證高滴度(du)及(ji)穩定的(de)質(zhi)量(liang)(liang)。
質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒中提得到的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒DNA的(de)量介于小提跟大(da)提之間，一般用30-50ml菌液(ye)提取(qu)(qu)，提取(qu)(qu)的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒可用于包(bao)括酶切、PCR、測序(xu)、連(lian)接、轉化、文庫篩(shai)選、體外翻譯、轉染一些常(chang)規(gui)的(de)傳(chuan)代細胞等。從50ml菌液(ye)中提取(qu)(qu)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒可到到500ul質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒濃度(du)為0.7-1ug/ul的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒。
質(zhi)(zhi)粒大(da)(da)提(ti)(ti)(ti)(ti)是質(zhi)(zhi)粒大(da)(da)量提(ti)(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)(qu)的(de)(de)簡稱(cheng)，有些(xie)實(shi)驗(yan)室稱(cheng)之為大(da)(da)抽。質(zhi)(zhi)粒大(da)(da)提(ti)(ti)(ti)(ti)用(yong)于(yu)大(da)(da)量菌(jun)(jun)液(ye)的(de)(de)提(ti)(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)(qu)，100ml-500ml 均(jun)可，大(da)(da)規模地從細菌(jun)(jun)中將(jiang)擴增的(de)(de)質(zhi)(zhi)粒提(ti)(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)(qu)出來(lai)。一般(ban)(ban)的(de)(de)大(da)(da)提(ti)(ti)(ti)(ti)質(zhi)(zhi)粒試劑(ji)(ji)盒都是使用(yong)純(chun)化柱，提(ti)(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)(qu)出來(lai)的(de)(de)質(zhi)(zhi)粒純(chun)度高(gao)，雜質(zhi)(zhi)少(shao)，無內毒素，一般(ban)(ban)用(yong)于(yu)細胞的(de)(de)轉染等對質(zhi)(zhi)粒純(chun)度高(gao)的(de)(de)實(shi)驗(yan)。從200ml菌(jun)(jun)液(ye)中提(ti)(ti)(ti)(ti)取(qu)(qu)(qu)質(zhi)(zhi)粒，1000ul洗脫(tuo)液(ye)洗脫(tuo)后得到的(de)(de)質(zhi)(zhi)粒濃度為0.5-2ug/ul。 維真生(sheng)物(wu)慢病(bing)毒、腺相關病(bing)毒（AAV）包裝(zhuang)一般(ban)(ban)使用(yong)大(da)(da)提(ti)(ti)(ti)(ti)試劑(ji)(ji)盒進行抽提(ti)(ti)(ti)(ti)，以保證高(gao)滴度及穩定的(de)(de)質(zhi)(zhi)量。
注(zhu)：在一個細(xi)(xi)菌(jun)細(xi)(xi)胞中(zhong)只有(you)5個以下的(de)(de)(de)相同質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)時，該(gai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)是低(di)拷(kao)(kao)貝(bei)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)；當在一個細(xi)(xi)菌(jun)細(xi)(xi)胞中(zhong)可以有(you)幾百個相同質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)時則(ze)該(gai)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)是高(gao)拷(kao)(kao)貝(bei)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)。低(di)拷(kao)(kao)貝(bei)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)在等(deng)量(liang)的(de)(de)(de)菌(jun)體(ti)中(zhong)的(de)(de)(de)數量(liang)遠低(di)于高(gao)拷(kao)(kao)貝(bei)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)，因(yin)此(ci)用等(deng)量(liang)菌(jun)體(ti)提(ti)取(qu)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)時，提(ti)取(qu)的(de)(de)(de)低(di)拷(kao)(kao)貝(bei)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)濃(nong)度會很低(di)。維真生物的(de)(de)(de)過表達載體(ti)是低(di)拷(kao)(kao)貝(bei)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)，對于此(ci)類質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)載體(ti)，若需(xu)要大(da)量(liang)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)或者小提(ti)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)實(shi)驗效(xiao)果(guo)不好(hao)時，則(ze)需(xu)要加大(da)提(ti)取(qu)的(de)(de)(de)菌(jun)體(ti)量(liang)，可進行質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)中(zhong)提(ti)或者大(da)提(ti)，另外，使用去(qu)內毒素(su)的(de)(de)(de)試劑盒抽提(ti)質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)時，也會降低(di)最終得(de)到質(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)濃(nong)度
質粒提取常見問(wen)題及解決方案
質(zhi)粒提取的常見問(wen)題
1、菌液較(jiao)多：可以通過幾次離心將菌(jun)(jun)體(ti)沉淀收集(ji)到一個(ge)離心管中。收集(ji)的菌(jun)(jun)體(ti)量以能夠充(chong)(chong)分(fen)裂(lie)解(jie)為佳，菌(jun)(jun)體(ti)過多(duo)裂(lie)解(jie)不充(chong)(chong)分(fen)會降低(di)質粒的提(ti)取效率(lv)。未徹底混勻(yun)的菌(jun)(jun)塊(kuai)會影響裂(lie)解(jie)，導(dao)致提(ti)取量和純度(du)偏低(di)，菌(jun)(jun)體(ti)懸浮后(hou)若(ruo)有較多(duo)的氣泡也會影響裂(lie)解(jie)，導(dao)致導(dao)致提(ti)取量和純度(du)偏低(di)。
質(zhi)粒(li)(li)(li)提取使用(yong)的(de)溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)I主要(yao)是(shi)(shi)懸浮菌(jun)體，溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)II裂解菌(jun)體，其中(zhong)的(de)高濃度NaOH破會細(xi)菌(jun)細(xi)胞(bao)壁和細(xi)胞(bao)膜，使菌(jun)體中(zhong)的(de)質(zhi)粒(li)(li)(li)DNA釋放出來，溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)III主要(yao)是(shi)(shi)中(zhong)和溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)，使溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)恢復中(zhong)性環境，利(li)于質(zhi)粒(li)(li)(li)DNA復性，溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)II中(zhong)SDS的(de)Na+會被K+置換，SDS變(bian)為PDS并(bing)結合(he)(he)大分(fen)(fen)子的(de)基(ji)因組DNA,蛋白質(zhi)和細(xi)胞(bao)碎(sui)片形成不溶(rong)(rong)(rong)(rong)物，然后通過離(li)心可(ke)以(yi)得(de)到(dao)(dao)含有(you)質(zhi)粒(li)(li)(li)DNA的(de)上(shang)清(qing)(qing)。因此加(jia)(jia)入溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)II后要(yao)溫和地混合(he)(he)，不要(yao)劇烈震蕩，以(yi)免(mian)使基(ji)因組DNA斷(duan)裂污染質(zhi)粒(li)(li)(li)。所用(yong)時間不應超過5min，以(yi)免(mian)質(zhi)粒(li)(li)(li)受到(dao)(dao)破壞。如(ru)果菌(jun)液(ye)(ye)沒(mei)有(you)變(bian)清(qing)(qing)亮，可(ke)能是(shi)(shi)由(you)于菌(jun)體過多，裂解不徹底(di)，若繼續(xu)進(jin)行(xing)后續(xu)操作會得(de)到(dao)(dao)鼻涕狀的(de)沉(chen)淀，無法通過離(li)心分(fen)(fen)離(li)得(de)到(dao)(dao)含有(you)DNA 的(de)上(shang)清(qing)(qing)液(ye)(ye)，因此在加(jia)(jia)入溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)Ⅱ后菌(jun)液(ye)(ye)沒(mei)有(you)變(bian)清(qing)(qing)亮后可(ke)以(yi)適(shi)當(dang)按比例加(jia)(jia)大溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)Ⅱ和后續(xu)溶(rong)(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)Ⅲ的(de)用(yong)量。
2、菌液培養時間：使用TB培(pei)(pei)養(yang)基培(pei)(pei)養(yang)菌(jun)(jun)(jun)(jun)液的(de)時(shi)(shi)間一般在(zai)(zai)17小時(shi)(shi)左右(you)，菌(jun)(jun)(jun)(jun)液OD值(zhi)在(zai)(zai)2.5-2.6左右(you)為佳，培(pei)(pei)養(yang)時(shi)(shi)間短會導致菌(jun)(jun)(jun)(jun)體生(sheng)長不充分，培(pei)(pei)養(yang)時(shi)(shi)間過長菌(jun)(jun)(jun)(jun)體會出現(xian)死亡(wang)，都會影響收集的(de)菌(jun)(jun)(jun)(jun)體量(liang)，從而影響抽提(ti)出的(de)質粒DNA的(de)量(liang)。在(zai)(zai)接(jie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)前，可以(yi)(yi)將保(bao)存的(de)菌(jun)(jun)(jun)(jun)種先進行活化，然后再接(jie)菌(jun)(jun)(jun)(jun)，可使過夜培(pei)(pei)養(yang)的(de)菌(jun)(jun)(jun)(jun)液生(sheng)長更充分，在(zai)(zai)一定范圍內菌(jun)(jun)(jun)(jun)體量(liang)的(de)增(zeng)加，可以(yi)(yi)提(ti)高(gao)所提(ti)質粒的(de)濃度。
3、宿主菌(jun)株：宿主(zhu)菌株的(de)(de)種(zhong)類(lei)將(jiang)會(hui)影(ying)響質(zhi)粒(li)的(de)(de)收獲量(liang)。含(han)內(nei)(nei)源核(he)酸(suan)酶(mei)的(de)(de)宿主(zhu)菌株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它們(men)的(de)(de)衍生菌株，通(tong)常因為內(nei)(nei)源核(he)酸(suan)酶(mei)的(de)(de)存在，或者(zhe)在提取過程中(zhong)釋放出來的(de)(de)核(he)酸(suan)酶(mei)的(de)(de)作用(yong)下，將(jiang)會(hui)顯著影(ying)響最終收獲量(liang)，或者(zhe)純化(hua)到的(de)(de)質(zhi)粒(li)容易降解，推薦將(jiang)質(zhi)粒(li)轉化(hua)至(zhi)不含(han)內(nei)(nei)源核(he)酸(suan)酶(mei)的(de)(de)宿主(zhu)菌株中(zhong)，如Top10, DH5a進(jin)行質(zhi)粒(li)純化(hua)。
4、質粒拷貝數低：由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時的體積。
5、菌體中無質粒：有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。有時菌種保存一段時間后會出現質粒丟失的情況，導致無法提出質粒，若有保存的質粒可以轉化后再挑取單克隆搖菌提質粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
6、堿裂解不充分：使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加裂解液的用量。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會導致裂解不充分，要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對低拷貝數質粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液，可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量。
7、溶液使用不當：溶液II在溫度較低時可能出現渾濁，可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，方可使用。
8、吸附柱過載：不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質粒是非常高的拷貝數或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養液體積。
9、質粒未全部溶解(尤其質粒較大時) ：洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
10、乙醇殘留：漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，可置于室溫靜置20-30分鐘，或放到超凈臺上風吹15分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。若第一次沒有將洗脫液準確加到硅膠膜的中心部位，可以離心后將離心下來的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。
12、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
13、洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
14、洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時在說明書的建議時間基礎上適當延長靜置或者洗脫兩次可達到較好的效果。
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