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質 粒 抽(chou) 提
質粒提取(qu)目的(de)
質粒是攜帶外源基(ji)因(yin)進(jin)入細菌中擴(kuo)增或者表(biao)達的重要(yao)媒介，這種基(ji)因(yin)運載工具(ju)在基(ji)因(yin)工程(cheng)中具(ju)有極廣泛的應用價值，要(yao)想從細菌中獲得質粒DNA,需要通(tong)過質粒提取的方法(fa)。
質粒提取的幾(ji)種方(fang)法(fa)及(ji)原(yuan)理
質粒提取主(zhu)要有堿裂解(jie)法(fa)，煮沸裂解(jie)法(fa)，小量一步(bu)提取法(fa)等。
1、堿裂解法原理：根據共價閉合環狀DNA與線性DNA的拓撲學結構差異來分離的。在強堿環境下，細菌的細胞壁和細胞膜被破壞，基因組DNA和質粒DNA被釋放出來，線性DNA雙螺旋結構被破壞而發生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環狀質粒DNA也會發生變性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起。當加入pH4.8的乙醋酸鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時，共價閉合環狀質粒DNA復性快，而線性的染色體DNA復性緩慢，細菌蛋白質、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物，后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時，復合物會從溶液中有效地沉淀下來，離心除去變性劑后，就可以從上清中回收復性的質粒DNA。
2、煮沸法裂解：將細菌懸浮于含Triton X-100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外，還有助于解開DNA鏈的堿基配對，并使蛋白質和染色體DNA變性。但是，閉環質粒DNA彼此不會分離，這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結構，當溫度下降后，閉環DNA的堿基又各自就位，形成超螺旋分子，離心除去變性的染色體核蛋白質，就可從上清中回收質粒DNA。
煮沸裂解法(fa)對于(yu)小(xiao)于(yu)15kb的小(xiao)質(zhi)(zhi)粒(li)很有(you)效，可用于(yu)提取步至lmL（小(xiao)量制備），多(duo)至250mL（大量制備）菌液的質(zhi)(zhi)粒(li)，并且(qie)對大多(duo)數的大腸桿菌菌株都適(shi)用。
3、小量一步提取法：由于細菌染色體DNA比質粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發生變性。同樣受機械力質粒DNA會變性，機械力消失后復性。但質粒DNA的復性快，仍溶于溶液而細菌染色體DNA復性較慢，會形成不溶的網狀結構，通過高速離心可以分離得到質粒DNA 。
質粒(li)提取方(fang)法選(xuan)擇
質(zhi)粒(li)(li)提(ti)取的(de)方(fang)法主要(yao)(yao)根(gen)據質(zhi)粒(li)(li)DNA分子量的(de)大(da)小，所用(yong)細菌(jun)的(de)種屬，細菌(jun)裂解(jie)釋放DNA后(hou)的(de)純(chun)化方(fang)法和(he)實驗要(yao)(yao)求(qiu)來選擇。
1、質(zhi)(zhi)粒(li)DNA的(de)分子(zi)大于15kb時，在(zai)質(zhi)(zhi)粒(li)抽提過(guo)程中(zhong)容易受損，可以采用比較(jiao)溫和(he)(he)的(de)裂解方法，將細(xi)菌(jun)懸(xuan)浮于等滲(shen)的(de)葡(pu)萄糖(tang)溶(rong)液中(zhong)，加(jia)入溶(rong)菌(jun)酶和(he)(he)EDTA破壞細(xi)胞壁和(he)(he)細(xi)胞膜，這樣可以緩解高滲(shen)透壓的(de)細(xi)菌(jun)在(zai)釋(shi)放質(zhi)(zhi)粒(li)DNA時的(de)壓力，保護(hu)質(zhi)(zhi)粒(li)DNA。
2、小分子的質粒DNA可以(yi)選用相對劇烈的方法(fa)來分離DNA。可以(yi)用煮沸(fei)法(fa)，堿裂(lie)解法(fa)或者加(jia)入(ru)溶菌酶，EDTA和去垢(gou)劑(ji)裂(lie)解細菌。這些(xie)方法(fa)會使DNA變(bian)性，但兩條互補鏈仍會互相盤繞，并緊密的結合在一起，在恢復正常條件后，DNA便會復性。
3、對于那些經變性劑、溶(rong)菌(jun)酶及加熱處理(li)后能釋放大量(liang)碳水(shui)化合物(wu)的(de)大腸桿菌(jun)菌(jun)株，則不(bu)推薦使用(yong)煮沸法(fa)。而(er)這(zhe)(zhe)(zhe)些碳水(shui)化合物(wu)在密度(du)梯度(du)中會緊靠超螺旋的(de)DNA分子形成致密模(mo)糊的(de)區帶，因此(ci)很難(nan)避免，而(er)這(zhe)(zhe)(zhe)些碳水(shui)化合物(wu)可抑(yi)制(zhi)多種限制(zhi)酶的(de)活性。這(zhe)(zhe)(zhe)類菌(jun)株制(zhi)備質粒時，不(bu)宜采用(yong)煮沸法(fa)。
4、菌株含(han)有(you)限制性核(he)酸內切酶A的不宜使(shi)用煮沸法(fa)。因為(wei)煮沸不能使(shi)內切酶A完(wan)全(quan)失活，在后續(xu)實驗中再用限制性內切酶消化時，質粒(li)DNA會(hui)被降解。此時必須(xu)用酚：氯仿(fang)進(jin)行(xing)抽(chou)提。
煮沸法時間短(duan)，（特點） 操作簡單，時間短(duan)；（缺點）條件過于(yu)劇烈(lie)，易造成質粒斷裂，回收率較低。
堿裂解法操作簡單，（特點） 所得質粒(li)量(liang)較多且污染(ran)少，（缺點）花費的時間較長。
質(zhi)粒(li)提取試劑(ji)盒選擇
1、小提質粒：（特點）簡單快速，可高通量提取 ；（濃度）100-200ng/ul；（用途）測序，PCR，腺病毒包裝、多數細胞轉染實驗
2、中提質粒：（特點）質粒DNA量較高，（濃度）0.7-1ug/ul；（用途）測序，多數細胞轉染實驗
3、大提質粒：（特點）質粒DNA量非常高，雜質少，無內毒素（濃度）0.5-2ug/ul （用途）慢病毒、腺相關病毒包裝，多數細胞轉染或其他需要大量質粒的實驗
大多(duo)數試劑盒(he)都是在堿裂解法的基礎上優化改(gai)進的。
常用的質粒提(ti)取試劑盒(he)有：OMEGA，BIOMIGA，Sigma，TaKaRa,promega,天(tian)根，康為世紀，生工等。
質粒抽提(ti)按(an)得(de)到質粒DNA的(de)量可(ke)分為小提(ti)，中(zhong)提(ti)，大提(ti)。
質(zhi)粒(li)(li)(li)小(xiao)提(ti)(ti)(ti)用(yong)的(de)菌液量(liang)(liang)很少，一(yi)般1-5ml，提(ti)(ti)(ti)出(chu)的(de)質(zhi)粒(li)(li)(li)DNA量(liang)(liang)較少，其特點是簡便、快(kuai)速，能(neng)同時處理大量(liang)(liang)試(shi)樣，所得(de)(de)DNA有(you)一(yi)定(ding)純度，此質(zhi)粒(li)(li)(li)DNA可直接(jie)用(yong)于(yu)DNA序列分析，各(ge)種酶促反應，PCR以(yi)及部分細胞系的(de)轉(zhuan)染(ran)等對質(zhi)粒(li)(li)(li)濃度要(yao)(yao)求(qiu)不(bu)高的(de)實驗。維真生物(wu)采用(yong)高通量(liang)(liang)小(xiao)提(ti)(ti)(ti)試(shi)劑盒，從1ml菌液中提(ti)(ti)(ti)取質(zhi)粒(li)(li)(li)，用(yong)90ul洗(xi)脫液洗(xi)脫得(de)(de)到的(de)質(zhi)粒(li)(li)(li)濃度為100-200ng/ul，可以(yi)滿足大部分實驗要(yao)(yao)求(qiu)，也可以(yi)直接(jie)用(yong)于(yu)一(yi)般的(de)腺病(bing)毒包(bao)裝(zhuang)(zhuang)，不(bu)過維真生物(wu)慢病(bing)毒、腺相關病(bing)毒（AAV）包(bao)裝(zhuang)(zhuang)一(yi)般使用(yong)大提(ti)(ti)(ti)試(shi)劑盒進行抽提(ti)(ti)(ti)，以(yi)保證高滴(di)度及穩定(ding)的(de)質(zhi)量(liang)(liang)。
質(zhi)粒(li)中提(ti)得到的(de)(de)質(zhi)粒(li)DNA的(de)(de)量介(jie)于(yu)小提(ti)跟大(da)提(ti)之間，一般用30-50ml菌(jun)液(ye)提(ti)取，提(ti)取的(de)(de)質(zhi)粒(li)可用于(yu)包括酶(mei)切、PCR、測序、連接、轉(zhuan)化、文(wen)庫篩(shai)選、體外(wai)翻譯(yi)、轉(zhuan)染一些常(chang)規(gui)的(de)(de)傳代細胞等(deng)。從50ml菌(jun)液(ye)中提(ti)取質(zhi)粒(li)可到到500ul質(zhi)粒(li)濃(nong)度為0.7-1ug/ul的(de)(de)質(zhi)粒(li)。
質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)大(da)(da)提是(shi)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)大(da)(da)量提取(qu)的(de)簡稱，有些實驗室(shi)稱之為(wei)大(da)(da)抽(chou)。質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)大(da)(da)提用于(yu)大(da)(da)量菌(jun)液(ye)的(de)提取(qu)，100ml-500ml 均可，大(da)(da)規(gui)模地(di)從細菌(jun)中(zhong)將擴增的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)提取(qu)出來(lai)。一般(ban)的(de)大(da)(da)提質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)試(shi)劑(ji)盒都是(shi)使用純化柱，提取(qu)出來(lai)的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)純度(du)高，雜質(zhi)(zhi)(zhi)少，無內毒素(su)，一般(ban)用于(yu)細胞的(de)轉(zhuan)染等對(dui)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)純度(du)高的(de)實驗。從200ml菌(jun)液(ye)中(zhong)提取(qu)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)，1000ul洗脫液(ye)洗脫后得到的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)濃度(du)為(wei)0.5-2ug/ul。 維(wei)真生物(wu)慢病毒、腺相關(guan)病毒（AAV）包裝一般(ban)使用大(da)(da)提試(shi)劑(ji)盒進行抽(chou)提，以保證高滴度(du)及(ji)穩(wen)定的(de)質(zhi)(zhi)(zhi)量。
注：在(zai)(zai)一(yi)個細(xi)菌細(xi)胞中只有5個以下的(de)(de)(de)相(xiang)同(tong)質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)時，該質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)是低(di)(di)拷貝質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)；當在(zai)(zai)一(yi)個細(xi)菌細(xi)胞中可以有幾(ji)百個相(xiang)同(tong)質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)時則該質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)是高(gao)(gao)拷貝質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)。低(di)(di)拷貝質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)在(zai)(zai)等量(liang)的(de)(de)(de)菌體(ti)中的(de)(de)(de)數量(liang)遠低(di)(di)于高(gao)(gao)拷貝質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)，因此用等量(liang)菌體(ti)提取質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)時，提取的(de)(de)(de)低(di)(di)拷貝質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)濃(nong)度會很低(di)(di)。維真生物的(de)(de)(de)過表達(da)載體(ti)是低(di)(di)拷貝質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)，對于此類質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)載體(ti)，若需(xu)要大(da)(da)量(liang)質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)或者小提質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)實驗效果不好時，則需(xu)要加大(da)(da)提取的(de)(de)(de)菌體(ti)量(liang)，可進行質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)中提或者大(da)(da)提，另外(wai)，使用去內毒素的(de)(de)(de)試劑盒抽提質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)時，也會降(jiang)低(di)(di)最終得到質(zhi)粒(li)(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)濃(nong)度
質粒(li)提取(qu)常見問題及解決(jue)方(fang)案
質粒提取的常見問題
1、菌液較多(duo)：可以通過(guo)幾(ji)次離(li)心將(jiang)菌(jun)(jun)(jun)體(ti)(ti)沉淀收(shou)集(ji)到一個離(li)心管中。收(shou)集(ji)的菌(jun)(jun)(jun)體(ti)(ti)量以能(neng)夠充(chong)分裂解(jie)為佳，菌(jun)(jun)(jun)體(ti)(ti)過(guo)多裂解(jie)不充(chong)分會(hui)降(jiang)低(di)(di)質粒(li)的提取(qu)效率。未徹底(di)混勻的菌(jun)(jun)(jun)塊會(hui)影響裂解(jie)，導致提取(qu)量和純度偏低(di)(di)，菌(jun)(jun)(jun)體(ti)(ti)懸浮后若有較多的氣泡(pao)也會(hui)影響裂解(jie)，導致導致提取(qu)量和純度偏低(di)(di)。
質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)提(ti)取使(shi)用(yong)的(de)(de)(de)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)I主(zhu)要是(shi)(shi)懸(xuan)浮菌(jun)體(ti)，溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)II裂(lie)解菌(jun)體(ti)，其中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)高(gao)濃度NaOH破會(hui)細菌(jun)細胞(bao)壁和(he)細胞(bao)膜，使(shi)菌(jun)體(ti)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)DNA釋放(fang)出來，溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)III主(zhu)要是(shi)(shi)中(zhong)(zhong)和(he)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)，使(shi)溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)恢(hui)復(fu)中(zhong)(zhong)性環境，利(li)于質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)DNA復(fu)性，溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)II中(zhong)(zhong)SDS的(de)(de)(de)Na+會(hui)被K+置換，SDS變為PDS并結合大分(fen)子的(de)(de)(de)基因(yin)組DNA,蛋白(bai)質(zhi)(zhi)(zhi)和(he)細胞(bao)碎(sui)片形成不(bu)溶(rong)(rong)(rong)物，然后通(tong)過(guo)離心可以(yi)得(de)(de)到(dao)含有(you)(you)質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)DNA的(de)(de)(de)上清(qing)。因(yin)此(ci)(ci)加(jia)入溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)II后要溫和(he)地混合，不(bu)要劇(ju)烈震蕩，以(yi)免使(shi)基因(yin)組DNA斷(duan)裂(lie)污染質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)。所用(yong)時間不(bu)應超過(guo)5min，以(yi)免質(zhi)(zhi)(zhi)粒(li)(li)受到(dao)破壞。如(ru)果菌(jun)液(ye)(ye)(ye)沒(mei)有(you)(you)變清(qing)亮，可能是(shi)(shi)由(you)于菌(jun)體(ti)過(guo)多，裂(lie)解不(bu)徹底，若繼續進(jin)行(xing)后續操(cao)作會(hui)得(de)(de)到(dao)鼻涕狀的(de)(de)(de)沉(chen)淀(dian)，無法通(tong)過(guo)離心分(fen)離得(de)(de)到(dao)含有(you)(you)DNA 的(de)(de)(de)上清(qing)液(ye)(ye)(ye)，因(yin)此(ci)(ci)在(zai)加(jia)入溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)Ⅱ后菌(jun)液(ye)(ye)(ye)沒(mei)有(you)(you)變清(qing)亮后可以(yi)適(shi)當(dang)按比例加(jia)大溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)Ⅱ和(he)后續溶(rong)(rong)(rong)液(ye)(ye)(ye)Ⅲ的(de)(de)(de)用(yong)量。
2、菌液培養時間：使(shi)用(yong)TB培養(yang)(yang)(yang)基培養(yang)(yang)(yang)菌(jun)液(ye)的(de)(de)時間一般在(zai)(zai)17小時左(zuo)(zuo)右(you)，菌(jun)液(ye)OD值在(zai)(zai)2.5-2.6左(zuo)(zuo)右(you)為佳，培養(yang)(yang)(yang)時間短會導致菌(jun)體(ti)生(sheng)長(chang)不充分，培養(yang)(yang)(yang)時間過(guo)長(chang)菌(jun)體(ti)會出現死亡，都會影(ying)響收集的(de)(de)菌(jun)體(ti)量(liang)(liang)，從而影(ying)響抽提(ti)出的(de)(de)質(zhi)粒DNA的(de)(de)量(liang)(liang)。在(zai)(zai)接菌(jun)前，可以將保存(cun)的(de)(de)菌(jun)種先進(jin)行活化，然(ran)后再接菌(jun)，可使(shi)過(guo)夜培養(yang)(yang)(yang)的(de)(de)菌(jun)液(ye)生(sheng)長(chang)更充分，在(zai)(zai)一定范圍內菌(jun)體(ti)量(liang)(liang)的(de)(de)增(zeng)加(jia)，可以提(ti)高(gao)所(suo)提(ti)質(zhi)粒的(de)(de)濃度(du)。
3、宿主(zhu)菌株：宿主(zhu)(zhu)菌(jun)株的(de)種類將(jiang)(jiang)會(hui)影(ying)(ying)響質粒(li)的(de)收獲量。含內(nei)源核(he)(he)酸(suan)(suan)酶的(de)宿主(zhu)(zhu)菌(jun)株，HB101, 如JM101, JM110, TG1以及它們(men)的(de)衍生菌(jun)株，通(tong)常因為(wei)內(nei)源核(he)(he)酸(suan)(suan)酶的(de)存在(zai)，或者在(zai)提取過程中釋放(fang)出來(lai)的(de)核(he)(he)酸(suan)(suan)酶的(de)作用下，將(jiang)(jiang)會(hui)顯著影(ying)(ying)響最終收獲量，或者純化到的(de)質粒(li)容易降解，推薦將(jiang)(jiang)質粒(li)轉化至不含內(nei)源核(he)(he)酸(suan)(suan)酶的(de)宿主(zhu)(zhu)菌(jun)株中，如Top10, DH5a進(jin)行質粒(li)純化。
4、質粒拷貝數低：由于使用低拷貝數載體引起的質粒DNA提取量低，可更換具有相同功能的高拷貝數載體，或者加大提取的菌液量，并減小洗脫時的體積。
5、菌體中無質粒：有些質粒本身不能在某些菌種中穩定存在，經多次轉接后有可能造成質粒丟失。例如，柯斯質粒在大腸桿菌中長期保存不穩定，因此不要頻繁轉接，每次接種時應接種單菌落。有時菌種保存一段時間后會出現質粒丟失的情況，導致無法提出質粒，若有保存的質粒可以轉化后再挑取單克隆搖菌提質粒。另外，檢查篩選用抗生素使用濃度是否正確。
6、堿裂解不充分：使用過多菌體培養液，會導致菌體裂解不充分，可減少菌體用量或增加裂解液的用量。菌體沉淀未能充分懸浮或懸浮后有較多氣泡也會導致裂解不充分，要注意讓菌體充分懸浮并將較多的氣泡用移液器吸出。對低拷貝數質粒，提取時可加大菌體用量并加倍使用試劑盒溶液，可以有助于增加質粒提取量和提高質粒質量。
7、溶液使用不當：溶液II在溫度較低時可能出現渾濁，可置于42℃水浴保溫片刻直至溶解為清亮的溶液，方可使用。
8、吸附柱過載：不同產品中吸附柱吸附能力不同，如果需要提取的質粒量很大，請分多次提取。若用富集培養基，例如TB或2×YT，菌液體積必須減少;若質粒是非常高的拷貝數或宿主菌具有很高的生長率，則需減少LB培養液體積。
9、質粒未全部溶解(尤其質粒較大時) ：洗脫溶解質粒時，可適當加溫或延長溶解時間。
10、乙醇殘留：漂洗液洗滌后應離心盡量去除殘留液體，再加入洗脫緩沖液。漂洗液中乙醇的殘留會影響后續的酶反應（酶切、PCR等）實驗。為確保下游實驗不受殘留乙醇的影響，可置于室溫靜置20-30分鐘，或放到超凈臺上風吹15分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液。
11、洗脫液加入位置不正確：洗脫液應加在硅膠膜中心部位以確保洗脫液會完全覆蓋硅膠膜的表面達到最大洗脫效率。若第一次沒有將洗脫液準確加到硅膠膜的中心部位，可以離心后將離心下來的洗脫液按正確方式重新上柱再次洗脫。
12、洗脫液不合適：DNA只在低鹽溶液中才能被洗脫，如洗脫緩沖液EB(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA，pH8.5)或水。洗脫效率還取決于pH值，最大洗脫效率在pH7.0-8.5間。當用水洗脫時確保其pH值在此范圍內，如果pH過低可能導致洗脫量低。洗脫時將滅菌蒸餾水或洗脫緩沖液加熱至60℃后使用，有利于提高洗脫效率。
13、洗脫體積太小：洗脫體積對回收率有一定影響。隨著洗脫體積的增大回收率增高，但產品濃度降低。為了得到較高的回收率可以增大洗脫體積。
14、洗脫時間過短：洗脫時間對回收率也會有一定影響。洗脫時在說明書的建議時間基礎上適當延長靜置或者洗脫兩次可達到較好的效果。
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