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上述如此(ci)絢麗多彩的圖片是科(ke)學(xue)(xue)家采用2007年哈佛大學(xue)(xue)腦科(ke)學(xue)(xue)中心開發(fa)的Brainbow（彩虹腦）技術對(dui)小(xiao)鼠海馬齒狀回(hui)DG進行多色標記的結果。
Brainbow是一項采用含多色熒光蛋白XFP的重組載體標記大腦的成像技術，其技術精髓就是XFP，技術核心是Cre/Loxp系統。具體來說，在Cre/Loxp系統的刪除或(和)顛倒作用下， 由(you)單個啟動子在(zai)一種細胞群中驅(qu)動兩到四個XFP隨機表(biao)(biao)達(da)；多(duo)(duo)個Brainbow轉(zhuan)基因拷(kao)貝的(de)整合誘發這(zhe)些XFP的(de)組合表(biao)(biao)達(da)，從而創造(zao)出更(geng)多(duo)(duo)的(de)色(se)彩。在(zai)神經(jing)系統中，由(you)此產生的(de)多(duo)(duo)色(se)標記可以用來區分相鄰的(de)神經(jing)元(yuan)細胞或膠質(zhi)細胞，并在(zai)追蹤(zong)神經(jing)環路的(de)同時確定神經(jing)元(yuan)突起(qi)的(de)身份(fen)，從而幫助(zhu)科學家解(jie)析大(da)腦(nao)。
那么，作為Brainbow技術精髓的XFP，我們又了解多少呢？本期我們將(jiang)帶領大家深入、全面地了解熒光蛋白。
熒光物質、激發光和熒光
我們在對樣品進行熒光成像時，首先樣品需要進行熒光標記，其次用某種波長的入射光進行照射，吸收光能后進入激發態，并且立即退激發并發出比入射光波長更長的發射光。在這過程中，用來標記樣品并使其具有發光性質的物質叫熒光物質，而照射樣品的入射光叫激發光，發出來的發射光就叫熒光。
發光原理
當熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)物質(zhi)(zhi)被(bei)激(ji)(ji)發(fa)(fa)光(guang)(guang)(guang)(guang)照射(she)后(hou)，激(ji)(ji)發(fa)(fa)光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)能(neng)量(liang)(liang)就(jiu)會供給熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)物質(zhi)(zhi)，熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)物質(zhi)(zhi)吸收(shou)(shou)能(neng)量(liang)(liang)后(hou)發(fa)(fa)生能(neng)級(ji)躍遷，即由低(di)能(neng)級(ji)的(de)(de)基態躍遷至高(gao)能(neng)級(ji)的(de)(de)激(ji)(ji)發(fa)(fa)態。而高(gao)能(neng)級(ji)的(de)(de)激(ji)(ji)發(fa)(fa)態不(bu)穩定，所以會恢復至低(di)能(neng)級(ji)的(de)(de)基態。在這(zhe)過(guo)程(cheng)中，熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)物質(zhi)(zhi)吸收(shou)(shou)的(de)(de)能(neng)量(liang)(liang)就(jiu)會以光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)形式進行釋(shi)放(fang)，從而產生熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)。而事實(shi)上，在能(neng)量(liang)(liang)釋(shi)放(fang)過(guo)程(cheng)中還有一(yi)部分(fen)是被(bei)喪失掉(diao)的(de)(de)，因此發(fa)(fa)射(she)光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)能(neng)量(liang)(liang)低(di)于激(ji)(ji)發(fa)(fa)光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)能(neng)量(liang)(liang)，相對應(ying)地，發(fa)(fa)射(she)光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)波長(chang)要比激(ji)(ji)發(fa)(fa)光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)波長(chang)長(chang)。熒(ying)光(guang)(guang)(guang)(guang)物質(zhi)(zhi)發(fa)(fa)光(guang)(guang)(guang)(guang)的(de)(de)整(zheng)個(ge)過(guo)程(cheng)可用(yong)Jablonski能(neng)量(liang)(liang)圖來表示（圖1）。
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熒光光譜
熒光光譜分為激發光譜和發射光譜兩種：激發光譜是熒光物質在不同波長的激發光作用下記錄的熒光強度隨激發光波長的變化情況；而發射光譜則是在固(gu)定波長的(de)(de)激發(fa)光(guang)作用(yong)下記(ji)錄(lu)的(de)(de)熒(ying)光(guang)強度隨發(fa)射光(guang)波長的(de)(de)變(bian)化情況(kuang)。
無論是(shi)激發(fa)光(guang)譜(pu)還是(shi)發(fa)射光(guang)譜(pu)，記錄的(de)均(jun)是(shi)熒(ying)光(guang)強調隨波(bo)(bo)長(chang)的(de)變(bian)化情況，不同的(de)是(shi)隨誰的(de)波(bo)(bo)長(chang)而變(bian)化。電(dian)磁(ci)波(bo)(bo)波(bo)(bo)普將有助于(yu)我們了解各波(bo)(bo)普的(de)波(bo)(bo)長(chang)，從而為我們設計實(shi)驗提供理(li)論基礎（圖(tu)2）。
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自1994年GFP首(shou)次(ci)被用于標記(ji)基因后(hou)，熒(ying)光(guang)蛋白（Fluorescent proteins，FPs）就(jiu)成(cheng)(cheng)了生命(ming)科學(xue)領域中非(fei)常(chang)重(zhong)要的(de)細(xi)胞(bao)成(cheng)(cheng)像工(gong)具(ju)之(zhi)一。這些FPs借助高分(fen)辯率(lv)顯微技(ji)術能夠幫(bang)助我們觀察先前無法看到的(de)生物過程(cheng)，如活細(xi)胞(bao)內(nei)的(de)代謝過程(cheng)、信號通路，大腦中的(de)突觸(chu)鏈(lian)接，癌細(xi)胞(bao)的(de)擴散(san)等(deng)。
熒光蛋白的結構
在1996年(nian)，GFP的(de)晶(jing)體結構(gou)被(bei)科學家成(cheng)(cheng)功解析：GFP是典型的(de)β桶形結構(gou)，包括11條β折疊和(he)(he)α螺旋：11條β折疊緊密交織在一起(qi)形成(cheng)(cheng)圓(yuan)柱狀的(de)“柵(zha)欄”，α螺旋上的(de)第65、66、67位氨(an)基酸(suan)（絲氨(an)酸(suan)、酪氨(an)酸(suan)、甘(gan)氨(an)酸(suan)）位于其正(zheng)中位置，在分(fen)子氧(yang)的(de)作用下，經過環化、脫(tuo)氫等作用最終(zhong)形成(cheng)(cheng)成(cheng)(cheng)熟的(de)熒(ying)光基團(tuan)，嚴密的(de)桶形結構(gou)保(bao)護著熒(ying)光基團(tuan)，防(fang)止(zhi)它被(bei)周圍環境淬(cui)滅(mie)（圖3a和(he)(he)3b）；N端(duan)和(he)(he)C端(duan)均暴(bao)露在外面。
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FPs的種類五花八門，就FPbase中收錄的就831種，幾乎覆蓋了從紫外光到遠紅外光的所有光譜波段。盡管這些FPs的光學特性大相徑庭，但是它們的結構卻極其相似。結構決定功能，人們對FPs結構的深刻認識對于理解其功能及拓展其范圍具有非常重要的理論意義。
合適熒光蛋白的選擇指南
面對(dui)琳(lin)瑯滿目(mu)的(de)FPs，研究人員在具體科學(xue)研究中往往受到一系列問題的(de)困擾(rao)，如哪(na)些FPs好用？哪(na)些FPs亮度高？哪(na)些因素影響理想FPs的(de)選擇？下面我們就(jiu)從如下幾方(fang)面一一展開討(tao)論，旨在為大家縮(suo)小選擇范圍提供參考。
①亮度/Brightness
FP的亮度由多種因素決定，包括FP固有的亮度（通常由其成熟速度和效率、消光系數、量子產量和光穩定性[長期實驗中]決定）、成像設備的光學特性（照射光的波長和強度，濾光片的光譜和二色鏡）和照相機或人眼對發射光譜的敏感性。雖然這(zhe)些因素無(wu)法從整體上(shang)鑒定更亮的(de)FP，但(dan)是(shi)在各個光(guang)譜波(bo)段內還(huan)是(shi)有(you)可能鑒定較亮的(de)FP，因為(wei)這(zhe)主要取(qu)決于其固有(you)的(de)光(guang)學特性(xing)。更亮的(de)FP意(yi)味著(zhu)可以用更低(di)的(de)激發光(guang)強度進(jin)行(xing)成(cheng)像(xiang)，從而更好地保護樣品免受光(guang)損(sun)傷。而且，更亮的(de)FP可以提(ti)供檢測(ce)和成(cheng)像(xiang)所需的(de)足夠信號。下表是(shi)各光(guang)譜波(bo)段推薦的(de)FPs（表1）。
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②表達/Expression
大多數FPs來(lai)源于海洋生物(wu)，而我們(men)研究的(de)基因大多數來(lai)自于哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)。這(zhe)兩種物(wu)種的(de)密(mi)碼子偏好(hao)性存(cun)在(zai)較大差(cha)異，這(zhe)種差(cha)異很可能(neng)會造(zao)成FP在(zai)哺(bu)乳(ru)動(dong)物(wu)表達系統(tong)中低表達甚至不表達，進而觀(guan)察不到熒光。因(yin)此(ci)，用于成(cheng)像實驗的(de)(de)FPs往(wang)往(wang)都需要(yao)根據(ju)所表(biao)(biao)達系統進行(xing)(xing)(xing)密碼子優(you)化，使其(qi)能(neng)夠很(hen)好地表(biao)(biao)達。慶(qing)幸的(de)(de)是，目前我(wo)們(men)(men)所使用的(de)(de)FPs已(yi)針對(dui)哺乳動物(wu)(wu)的(de)(de)密碼子進行(xing)(xing)(xing)了優(you)化，而(er)且可以很(hen)好地表(biao)(biao)達。FPs需要(yao)經歷轉錄(lu)、翻譯(yi)、折疊、熒(ying)光基團形成(cheng)等步驟形成(cheng)成(cheng)熟蛋(dan)白(bai)(bai)后(hou)才能(neng)發光。雖然，大多數經過(guo)密碼子優(you)化的(de)(de)FPs能(neng)在哺乳動物(wu)(wu)系統中很(hen)好地表(biao)(biao)達，但(dan)是其(qi)折疊效率有(you)快有(you)慢，從而(er)決定了其(qi)成(cheng)熟時間(jian)不同。因(yin)此(ci)，FPs的(de)(de)成(cheng)熟時間(jian)也(ye)需考(kao)慮在內，在進行(xing)(xing)(xing)目標蛋(dan)白(bai)(bai)亞細胞定位時，我(wo)們(men)(men)需要(yao)根據(ju)其(qi)壽(shou)命選擇相應的(de)(de)FP。
③ 光穩定性/Photostability
所有FPs最終(zhong)都會(hui)在長時間的激發光(guang)照(zhao)射下發生(sheng)光(guang)漂白，從而逐漸喪失發光(guang)能(neng)力，但(dan)是其光(guang)漂白速率迥異。因(yin)此(ci)，針(zhen)對(dui)不(bu)(bu)同的(de)(de)(de)成(cheng)像實(shi)驗，我們(men)需要選擇不(bu)(bu)同光穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)的(de)(de)(de)FP：對(dui)于(yu)(yu)需要不(bu)(bu)多(duo)于(yu)(yu)10張圖(tu)(tu)片(pian)(pian)的(de)(de)(de)短期成(cheng)像實(shi)驗，光穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)通(tong)常不(bu)(bu)是一(yi)個主要考(kao)慮因(yin)素，但在需要大量圖(tu)(tu)片(pian)(pian)的(de)(de)(de)長期成(cheng)像實(shi)驗中，選擇極(ji)具光穩(wen)定(ding)(ding)性(xing)的(de)(de)(de)FP是實(shi)驗成(cheng)功的(de)(de)(de)關(guan)鍵(jian)。
④聚合性質/Oligomerization
對于(yu)蛋白(bai)亞細胞(bao)定位(wei)(wei)實驗，我們在(zai)構(gou)建(jian)熒光融合蛋白(bai)時要(yao)選擇單體(ti)性(xing)質的(de)FPs，因(yin)為多(duo)聚(ju)體(ti)的(de)FPs很可能(neng)會(hui)能(neng)影(ying)響(xiang)目標蛋白(bai)的(de)功(gong)能(neng)或(huo)定位(wei)(wei)。
⑤環境敏感性/Environmental sensitivity
大多(duo)數(shu)FPs具有不同程度的(de)(de)(de)酸(suan)敏感性(xing)，有的(de)(de)(de)適(shi)合(he)在酸(suan)性(xing)環境(jing)下(xia)(xia)使(shi)用，有的(de)(de)(de)適(shi)合(he)在堿性(xing)環境(jing)下(xia)(xia)使(shi)用，因此(ci)，在不同酸(suan)堿度溶液成像(xiang)中，我們選擇(ze)FPs時還(huan)需考慮其PK 值（用于指示FPs的(de)(de)(de)pH敏感性(xing)，PK 值越(yue)小酸(suan)性(xing)越(yue)強）。在(zai)特定條件下(xia)，那些對pH敏感(gan)的(de)(de)FPs可(ke)以指(zhi)示細胞內酸堿度的(de)(de)變化，例如單標(biao)（GFP-LC3B）和雙標(biao)（mCherry-GFP-LC3B）自噬指(zhi)示系(xi)統(tong)就(jiu)是(shi)利用了GFP和mCherry不(bu)同的(de)(de)酸敏感(gan)性來追蹤自噬流的(de)(de)。
⑥多色標記/Multiple labeling
自GFP被首次用(yong)于標(biao)記基因后，水母來(lai)源的(de)GFP不(bu)斷被改(gai)造，得到(dao)了大量藍色、青色和(he)黃色的(de)衍生物(wu)。同時，來(lai)自其他物(wu)種的(de)FPs也(ye)被陸續鑒定，進一步將FPs的(de)顏(yan)色拓展至橙色、紅(hong)色和(he)紅(hong)外光(guang)譜區。從(cong)FPs被改造的(de)(de)整個過程，我(wo)們(men)可以(yi)看出，FPs的(de)(de)改造趨向紅移(yi)。因為FPs越(yue)紅越(yue)好，顏色(se)越(yue)紅意味著波長(chang)越(yue)長(chang)，對(dui)應的(de)(de)激發光(guang)(guang)波長(chang)也更長(chang)，長(chang)波長(chang)光(guang)(guang)的(de)(de)激發對(dui)細胞和(he)組織的(de)(de)光(guang)(guang)損傷(shang)小，且背景自發熒光(guang)(guang)和(he)動物組織的(de)(de)光(guang)(guang)吸收都(dou)非常小，組織穿透(tou)力強（圖4）。這些特征使得紅色(se)FPs更適合于體(ti)內深(shen)組織成像。
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這些五顏六色(se)的(de)FPs為我們選擇(ze)FPs進行多(duo)色(se)標記實驗提供了豐(feng)富的(de)資源。值得注意的(de)是(shi)，在選擇(ze)FPs顏色(se)的(de)同時還要兼顧它(ta)們的(de)兼容性：一個好(hao)的(de)經驗法(fa)則(ze)是(shi)，兩種FPs的(de)峰激發波長和峰值發射(she)波長均應相隔50-60nm。
⑦設備兼容性/Opitical setup
選擇FPs進行成像實驗時，所選FPs的光譜范圍需滿足實驗室現有成像設備的需求，畢竟重新購買成像設備成本還是比較高的。推薦使用的成像設備濾光片組合見表2。
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熒光蛋白的應用
如(ru)今，FPs作為標記蛋白和(he)報告(gao)蛋白被廣泛應(ying)用于生命科(ke)學研(yan)究的(de)諸多領域，以研(yan)究生命系統的(de)組(zu)織(zhi)和(he)功能（圖5）。
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①標記蛋白
作為標記蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)，構(gou)(gou)建(jian)熒光融合蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)(Fluorescent Fusion Protein, FFP)可以(yi)用于研究蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)定(ding)位(wei)(wei)，追蹤其(qi)動態(tai)變化(hua)，追溯其(qi)歷史和研究蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)之間(jian)的(de)(de)相互作用。那(nei)么，如何構(gou)(gou)建(jian)FFP呢？在設計FFP時，我(wo)(wo)們需要考慮多方面(mian)的(de)(de)因素，如FFP的(de)(de)預期用途(tu)，選(xuan)擇哪種FP，插入位(wei)(wei)置等等。隨(sui)著FPs的(de)(de)發(fa)現和發(fa)展，很多熒光蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)載(zai)(zai)體可通過商業(ye)化(hua)公司(si)獲(huo)得。縱觀這(zhe)些載(zai)(zai)體，FP通常位(wei)(wei)于多克隆位(wei)(wei)點(dian)附近(jin)（即目標蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)(de)N端或C端，圖6）。在根(gen)據上述(shu)FP選(xuan)擇指南選(xuan)定(ding)載(zai)(zai)體后，我(wo)(wo)們僅(jin)需通過簡單的(de)(de)亞克隆技術(shu)將目標蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)克隆至多克隆位(wei)(wei)點(dian)區即可。當FP位(wei)(wei)于目標蛋(dan)(dan)(dan)(dan)(dan)白(bai)(bai)(bai)C端時，為了確保兩(liang)者的(de)(de)正確折疊和功(gong)能，一段由2-10個氨基酸組成的(de)(de)鏈接序列（GS間(jian)隔，linker）往往是有用的(de)(de)。
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但是，在許多情(qing)(qing)況(kuang)下，我們(men)需(xu)要根據(ju)目標蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)實際情(qing)(qing)況(kuang)修飾FFP，如內質網蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)和膜(mo)(mo)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)：一個典(dian)型的(de)內質網蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)通常(chang)(chang)含(han)有(you)兩段(duan)關鍵序(xu)列(lie)（信(xin)號(hao)序(xu)列(lie)，SS；內質網滯留序(xu)列(lie)，KDEL），若其功(gong)能(neng)域(yu)靠近(jin)(jin)C端，FP應(ying)置(zhi)于(yu)(yu)SS下游2-10個氨基酸處(chu)，這(zhe)樣(yang)可以(yi)提高SS的(de)切割效(xiao)率，并有(you)利于(yu)(yu)FFP的(de)內質網易位；若其功(gong)能(neng)域(yu)靠近(jin)(jin)N端，FP應(ying)插入(ru)KDEL之前；對于(yu)(yu)單(dan)次(ci)跨膜(mo)(mo)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)，FP不(bu)能(neng)置(zhi)于(yu)(yu)跨膜(mo)(mo)結構(gou)域(yu)(TMD)內/附近(jin)(jin)，因為這(zhe)將破(po)壞結構(gou)域(yu)并導致膜(mo)(mo)整合的(de)問(wen)題；對于(yu)(yu)多次(ci)跨膜(mo)(mo)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)，除了單(dan)次(ci)跨膜(mo)(mo)蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)的(de)不(bu)適位置(zhi)外，FP也不(bu)可置(zhi)于(yu)(yu)TMDs之間的(de)環內，因為TMDs之間的(de)精確(que)間距對于(yu)(yu)其正確(que)折疊非常(chang)(chang)重要，且這(zhe)些環通常(chang)(chang)包含(han)功(gong)能(neng)域(yu)（圖7）。另外，還有(you)些目標蛋(dan)(dan)(dan)白(bai)在成熟過程中會切掉一段(duan)，如自噬標志(zhi)物LC3。
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總(zong)之，不管如(ru)何(he)構(gou)建FFP，我們均(jun)需要確(que)(que)保FFP的序列正確(que)(que)，并通過實驗(yan)確(que)(que)認其是(shi)(shi)否(fou)發光(guang)，其定位模式是(shi)(shi)否(fou)與目標蛋(dan)白(bai)的類似，是(shi)(shi)否(fou)保留有目標蛋(dan)白(bai)的功能等等。
②報告蛋白
作為報告蛋白，FPs借助極具市場前景的AAV病毒載體被廣泛應用于神經科學研究的各個階段，包括神經標記，基因操作，生理操縱和生理觀察。下面我們僅列舉幾個例子說明：
案例1：FPs用于標記全腦和局部腦區的神經細胞（圖8）
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隨著(zhu)技術的(de)(de)(de)進(jin)步，越來(lai)(lai)越多的(de)(de)(de)FPs被開發并應用。因(yin)此(ci)，科(ke)(ke)研(yan)人對于(yu)FPs可以(yi)(yi)說是眾所周知。盡管目(mu)前已有的(de)(de)(de)FPs為科(ke)(ke)研(yan)人的(de)(de)(de)各種(zhong)成像實(shi)(shi)驗帶來(lai)(lai)了(le)眾多選(xuan)擇(ze)。但是，隨著(zhu)研(yan)究的(de)(de)(de)深入，科(ke)(ke)研(yan)人對于(yu)成像實(shi)(shi)驗提出了(le)更(geng)高的(de)(de)(de)需(xu)求，尤(you)其在神經網絡縱橫(heng)交錯(cuo)的(de)(de)(de)神經系(xi)統中體(ti)現地淋漓盡致。未來(lai)(lai)，亮度高、穩定(ding)性(xing)高的(de)(de)(de)單體(ti)FPs將(jiang)可以(yi)(yi)進(jin)行更(geng)密集的(de)(de)(de)成像實(shi)(shi)驗；高效折疊的(de)(de)(de)單體(ti)光(guang)(guang)轉換FPs將(jiang)提高我們光(guang)(guang)標記融合蛋白的(de)(de)(de)能(neng)力，FPs光(guang)(guang)譜的(de)(de)(de)長波長端將(jiang)繼(ji)續拓寬，使科(ke)(ke)研(yan)人能(neng)夠(gou)在深組(zu)織和整個動物中進(jin)行更(geng)靈敏、更(geng)高效的(de)(de)(de)成像實(shi)(shi)驗。
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