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分子克隆技術又稱基因克隆或DNA重組技術，是在體(ti)外對(dui)DNA分(fen)子(zi)按照既定的(de)目的(de)和方案進行人工重(zhong)組，然后將(jiang)重(zhong)組分(fen)子(zi)（目的(de)基因或DNA片段與合(he)適(shi)的(de)載體(ti)連(lian)接）導入到合(he)適(shi)的(de)受(shou)體(ti)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)，使其在細(xi)(xi)胞(bao)(bao)中(zhong)復制與擴增，以獲得多拷貝(bei)的(de)DNA分(fen)子(zi)，并使受(shou)體(ti)細(xi)(xi)胞(bao)(bao)獲得新的(de)遺傳特征的(de)過(guo)程(cheng)。
1. 目的基因克隆
從特(te)定的(de)生物基因組或cDNA中分離和擴大(da)繁殖獲得足(zu)夠量的(de)目的(de)基因或 cDNA序列。
2. 載體的準備
選擇(ze)合適的(de)載(zai)體，并對載(zai)體DNA進行克隆(long)，制備足夠量的(de)達(da)到一定純(chun)度的(de)載(zai)體。
3. 目的基因與載體的酶切、連接
選擇適當的(de)克(ke)隆策略，將目的(de)基因連接于載體的(de)多克(ke)隆位點(dian)或啟動子(zi)和(he)終止(zhi)子(zi)之間，實現 DNA 重組。
4. 重組DNA轉化/轉染/轉導
將重組DNA轉化/轉染/轉導進入大腸桿(gan)菌細胞(bao)、酵母(mu)菌細胞(bao)、植物外植體或動物細胞(bao)。
5. 重組體的篩選與鑒定
利用載(zai)體上提供(gong)的(de)選擇標記基(ji)(ji)因(yin)進行(xing)篩(shai)選，獲得(de)具有重組DNA分(fen)子的(de)陽性克隆，或通過植(zhi)株(zhu)再生(sheng)、胚(pei)移(yi)植(zhi)等(deng)手段獲得(de)轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)植(zhi)株(zhu)或轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)動物(wu)。還需對所獲得(de)的(de)轉(zhuan)(zhuan)化(hua)細胞、轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)植(zhi)株(zhu)或轉(zhuan)(zhuan)基(ji)(ji)因(yin)動物(wu)進行(xing)分(fen)子鑒定。
6. 重組體的大量培養，外源基因表達效應分析與開發應用
將經篩選和鑒定出來的(de)大腸(chang)桿菌、酵母轉化細胞進(jin)行大量擴大繁殖，對外源基因的(de)表達蛋白進(jin)行分(fen)離與純化并進(jin)行后續結構與功能的(de)研究。
載體是用(yong)于攜帶(dai)重(zhong)組(zu)DNA，并且能(neng)夠使(shi)外源DNA一(yi)起復制與表達的運載工具。
質粒(li)是一種獨立于宿(su)主細胞(bao)染色體(ti)以外，能獨立自主復制的遺傳單位。它們常見的形式是細菌(jun)中(zhong)環狀的雙鏈DNA分(fen)子，有的也存在(zai)于古(gu)細菌(jun)和(he)真核(he)生物中(zhong)，其大小(xiao)在(zai)1～200kb不等。質粒(li)是“裸”DNA，不編碼必要(yao)的基因，在(zai)自然界中(zhong)，質粒(li)通(tong)常攜帶有利于有機體(ti)生存的基因，并賦予(yu)諸如抗生素耐(nai)藥性等選擇優(you)勢(shi)。
質(zhi)粒在(zai)遺傳工程中占(zhan)有(you)重(zhong)要的(de)(de)位(wei)置，它(ta)被認為(wei)是復(fu)制子，能夠(gou)在(zai)合適(shi)的(de)(de)宿(su)主(zhu)內(nei)自(zi)主(zhu)復(fu)制的(de)(de)DNA單位(wei)，被廣泛用作分子克隆(long)的(de)(de)載(zai)體，驅動(dong)宿(su)主(zhu)體內(nei)重(zhong)組(zu)DNA序列(lie)的(de)(de)復(fu)制，在(zai)實驗室(shi)中，質(zhi)粒可(ke)以通(tong)過轉(zhuan)化(hua)進(jin)入細胞(bao)。
質粒可以按(an)照多(duo)種方(fang)式進行分(fen)類。
1、按照質粒能否通過細菌的接合作用，可分為接合性質粒和非接合性質粒。接(jie)(jie)合(he)質(zhi)粒(li)含有(you)促進不同細(xi)胞間(jian)性結合(he)的(de)轉移基(ji)因，在復雜的(de)接(jie)(jie)合(he)過程中，質(zhi)粒(li)可通(tong)過某些轉移基(ji)因編碼的(de)性菌(jun)毛從一(yi)個細(xi)菌(jun)轉移到另一(yi)個細(xi)菌(jun)，非接(jie)(jie)合(he)質(zhi)粒(li)不能(neng)起始接(jie)(jie)合(he)，因此只(zhi)能(neng)借助接(jie)(jie)合(he)質(zhi)粒(li)進行轉移。
2、根據質粒的不相容性，可分為不相容性和相容性。一(yi)個(ge)微(wei)生物可以容納不同(tong)類(lei)型的質粒，但不同(tong)的質粒只(zhi)有在(zai)相(xiang)容的情(qing)況下(xia)才能存(cun)在(zai)于一(yi)個(ge)細菌細胞中(zhong)(zhong)(zhong)。如果兩個(ge)質粒不相(xiang)容，其中(zhong)(zhong)(zhong)一(yi)個(ge)或另(ling)一(yi)個(ge)會迅速(su)從細胞中(zhong)(zhong)(zhong)消失。
3、根據復制性質，可分為嚴緊控制型和松弛控制型。嚴緊控制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)型質粒(li)的復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酶系與染色體(ti)DNA復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)共(gong)用，只能在細胞(bao)(bao)周(zhou)期(qi)的一定階(jie)段進(jin)行復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，當細胞(bao)(bao)染色體(ti)停止復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)時(shi)，質粒(li)也就(jiu)不再復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。松弛控制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)型的質粒(li)的復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酶系不受染色體(ti)DNA復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)酶系的影響，在整(zheng)個細胞(bao)(bao)生長周(zhou)期(qi)中隨時(shi)都可(ke)以(yi)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)，在染色體(ti)復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)已經停止時(shi)質粒(li)仍能繼(ji)續復(fu)(fu)制(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)(zhi)。
4、此外，根據質粒的功能不同，質(zhi)粒(li)還有如下的(de)分類，如致育質(zhi)粒(li)、抗(kang)性質(zhi)粒(li)、Col質(zhi)粒(li)、降解質(zhi)粒(li)、侵入性質(zhi)粒(li)。
用(yong)于攜帶(dai)DNA片段進(jin)入宿(su)(su)(su)主(zhu)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)復(fu)制(zhi)或保存的載體必須滿(man)足(zu)以下基(ji)(ji)本條件：①具(ju)(ju)有(you)對受體細(xi)胞(bao)的可轉移性(xing)，能攜帶(dai)外源其因進(jin)入宿(su)(su)(su)主(zhu)細(xi)胞(bao)；②能在宿(su)(su)(su)主(zhu)細(xi)胞(bao)中自主(zhu)復(fu)制(zhi)，并實現(xian)外源基(ji)(ji)因的增殖；③具(ju)(ju)有(you)由單一限制(zhi)性(xing)內切核酸酶(mei)識別(bie)位點(dian)組(zu)(zu)成(cheng)的多克隆位點(dian)（mulfiple cloning site，MCS），可供外源基(ji)(ji)因的插入；④具(ju)(ju)有(you)合適(shi)的選(xuan)擇性(xing)標記，用(yong)于含有(you)重組(zu)(zu)質粒(li)的宿(su)(su)(su)主(zhu)細(xi)胞(bao)篩選(xuan)。
天然質粒往往存在這樣或那樣的缺陷，不適宜直接用作克隆載體，常需要進行人工改造。結合上述條件，這些改造也就主要集中在以下幾個方面∶
（1）選擇合適的復制起始位點。為了使構(gou)建的質粒克隆載體(ti)能在受體(ti)細(xi)胞(bao)中進行有(you)效復(fu)制，且獲得足夠數量的拷貝數，需要改變復(fu)制起(qi)始位點，一(yi)般選擇組裝(zhuang)松散(san)型質粒復(fu)制起(qi)始位點。
（2）加入合適的選擇標記基因。為便于(yu)重組子(zi)篩選，需(xu)要(yao)在質粒克隆載(zai)體上加入合(he)適(shi)的標記基因(yin)(yin)(yin)(yin)，主(zhu)要(yao)有β-半乳糖苷酶基因(yin)(yin)(yin)(yin)（lacZ）和抗(kang)(kang)(kang)(kang)生素(su)抗(kang)(kang)(kang)(kang)性(xing)基因(yin)(yin)(yin)(yin)。前者用于(yu)克隆子(zi)藍、白斑(ban)篩選；常用的抗(kang)(kang)(kang)(kang)生素(su)抗(kang)(kang)(kang)(kang)性(xing)基因(yin)(yin)(yin)(yin)主(zhu)要(yao)有氨芐青霉(mei)素(su)抗(kang)(kang)(kang)(kang)性(xing)其因(yin)(yin)(yin)(yin)（ampicillin resistance gene，ampr)、四環素(su)抗(kang)(kang)(kang)(kang)性(xing)基因(yin)(yin)(yin)(yin)（tetracycline resistance gene，tetr）、氯霉(mei)素(su)抗(kang)(kang)(kang)(kang)性(xing)基因(yin)(yin)(yin)(yin)（chloramphenicol resistance gene，cmr）、卡那(nei)霉(mei)素(su)抗(kang)(kang)(kang)(kang)性(xing)其因(yin)(yin)(yin)(yin)（kanamycin resistance gene，kanr）和新霉(mei)素(su)抗(kang)(kang)(kang)(kang)性(xing)基因(yin)(yin)(yin)(yin)（neomycin resistance gene，neor）等(deng)。
（3）增加或減少酶切位點。質粒載(zai)體利用限(xian)制性(xing)(xing)內(nei)切(qie)(qie)核(he)酸(suan)酶(mei)識別(bie)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)來作為外(wai)源DNA片段插入的(de)(de)(de)克隆位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)，這種位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)必須是單(dan)一(yi)酶(mei)切(qie)(qie)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)，而且數(shu)量越(yue)多越(yue)便于多種類型末端(duan)的(de)(de)(de)DNA插入。可通過刪(shan)除天然質粒中的(de)(de)(de)部(bu)分重復的(de)(de)(de)限(xian)制性(xing)(xing)內(nei)切(qie)(qie)核(he)酸(suan)酶(mei)識別(bie)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)使之成為單(dan)一(yi)酶(mei)切(qie)(qie)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)，也(ye)可通過增加(jia)新的(de)(de)(de)單(dan)一(yi)限(xian)制性(xing)(xing)內(nei)切(qie)(qie)核(he)酸(suan)酶(mei)位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)，在特定的(de)(de)(de)部(bu)位(wei)（如在篩選標記基因上）組裝一(yi)個含有(you)多種單(dan)一(yi)限(xian)制性(xing)(xing)內(nei)切(qie)(qie)核(he)酸(suan)酶(mei)識別(bie)序列的(de)(de)(de)多克隆位(wei)點(dian)(dian)(dian)(dian)（MCS）。
（4）縮短長度。質粒(li)轉(zhuan)化(hua)受體細(xi)胞的(de)(de)效率(lv)同(tong)質粒(li)DNA分子大小相關(guan)，小分子質量(liang)質粒(li)轉(zhuan)化(hua)效率(lv)較高(gao)。可通(tong)過切去質粒(li)上不必要的(de)(de)片段(duan)，提高(gao)轉(zhuan)化(hua)宿主(zhu)細(xi)胞的(de)(de)效率(lv)，提高(gao)其外源 DNA 片段(duan)的(de)(de)裝(zhuang)載量(liang)。
經過改進和創新的克隆載體越來越小、容量越來越大、工作效率越來越高、使用也越來越方便。
病毒載體是(shi)指(zhi)以病(bing)毒(du)為基(ji)礎的(de)(de)基(ji)因(yin)(yin)(yin)載(zai)體(ti)(ti)，具體(ti)(ti)方(fang)法是(shi)對(dui)病(bing)毒(du)基(ji)因(yin)(yin)(yin)組進行操作(zuo)和改造(zao)，使它(ta)攜帶外源基(ji)因(yin)(yin)(yin)和相關基(ji)因(yin)(yin)(yin)元件，并被包裝成(cheng)病(bing)毒(du)顆粒(li)，病(bing)毒(du)載(zai)體(ti)(ti)是(shi)一種常見的(de)(de)分子生(sheng)物學工(gong)具。用于基(ji)因(yin)(yin)(yin)導入并能在臨(lin)床開(kai)展研究(jiu)的(de)(de)病(bing)毒(du)載(zai)體(ti)(ti)一般應(ying)具備以下基(ji)本(ben)條件：
①攜帶外源基因并能包裝成病毒顆粒；
②介導外源基因的轉移和表達；
③對(dui)人體不(bu)致病；
④在環境中不(bu)會引起增殖和傳(chuan)播(bo)。
非病毒載體一般是指質(zhi)粒DNA，也可以是無載體的(de)(de)核酸，如反義寡核苷酸、Ribozyme、siRNA等，它是利用非病毒的(de)(de)載體材料的(de)(de)物化性質(zhi)來介導基因的(de)(de)轉移。
（含原(yuan)核(he)(he)和真(zhen)核(he)(he)2個復制子，能夠在原(yuan)核(he)(he)和真(zhen)核(he)(he)兩種宿主細(xi)胞(bao)中復制，并可(ke)以在真(zhen)核(he)(he)細(xi)胞(bao)中有效(xiao)表(biao)達(da)）。
克隆載體：具有(you)克(ke)隆載(zai)體(ti)的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以攜帶DNA片段(duan)或外源基因(yin)進入受(shou)體(ti)細胞并克(ke)隆和大量擴(kuo)增DNA片段(duan)（基因(yin)）的載(zai)體(ti)。
表達載體：克隆載(zai)體(ti)中加入一些與表達調控（具有轉(zhuan)錄/翻譯(yi)所必(bi)需(xu)的(de)(de)DNA順(shun)序）有關的(de)(de)元件即(ji)稱為(wei)表達載(zai)體(ti)。
原核表達載體即能攜帶(dai)插入(ru)的(de)外源基因序(xu)列進(jin)入(ru)原核細(xi)胞中進(jin)行(xing)表(biao)達的(de)載體。
①啟動子
啟動子的強弱是影響表達量的決定因素之一，原核表達載體啟動子主要有lac、 trp、tac、T7噬菌體啟動子和IPL啟動子。乳糖操縱子中lac啟動子的轉錄可通過CAP和cAMP來激活，又被調節基因產生的阻遏蛋白與操縱基因結合所阻止。乳糖類似物 IPTG可與阻遏蛋白結合解除阻礙，因此可用IPTG來調控 lac啟動子的表達。色氨酸啟動子trp的阻遏蛋白須與色氨酸結合才有活性。tac是由lac和trp構建的雜合啟動子，受IPTG的誘導，啟動能力比lac和trp強。T7噬菌體啟動子具有高度特異性，只有T7 RNA聚合酶才能使其啟動，而且T7 RNA聚合酶比大腸桿菌聚合酶活性高得多，可用來高效表達基因。IPL是噬菌體的早期左向啟動子，活性比trp高11倍，受溫度的調(diao)控。
②轉錄終止子
在構建(jian)表達載(zai)體時，為了(le)穩定載(zai)體系統，防止(zhi)克(ke)隆的外源基因表達干(gan)擾載(zai)體的穩定性，一般在多克(ke)隆位點的下游插(cha)入一段轉錄終(zhong)止(zhi)子。
③核糖體結合位點
轉錄出(chu)的(de)mRNA必(bi)須(xu)借助宿主細(xi)胞的(de)蛋(dan)白質合成系(xi)統(tong)翻(fan)譯出(chu)目(mu)的(de)蛋(dan)白。細(xi)胞中的(de)核糖(tang)體必(bi)須(xu)在mRNA上找到(dao)有(you)效核糖(tang)體結合位點以及(ji)其中的(de)SD（Shine-Dalgarno）序列，從(cong)而(er)啟動臨近(jin)的(de)翻(fan)譯起始密碼子的(de)蛋(dan)白質翻(fan)譯。核糖(tang)體結合位點可(ke)由目(mu)的(de)基因自(zi)己帶入，也(ye)可(ke)利用載體預先裝(zhuang)載（一般要(yao)與(yu)ATG相隔3～11 bp）。
①組成型表達 T7噬菌體啟動(dong)子等屬于組(zu)成型啟動(dong)子，在該類(lei)啟動(dong)子的驅動(dong)下，外源(yuan)基因源(yuan)源(yuan)不(bu)斷地表(biao)選。組(zu)成型表(biao)達通(tong)常產量高(gao)，但不(bu)適合表(biao)達一些對宿主細(xi)胞有害的蛋白。
②誘導型表達 lac及其衍生tac啟(qi)動子(zi)(zi)都是IPTG誘導(dao)(dao)型啟(qi)動子(zi)(zi)，trp是色氨酸誘導(dao)(dao)型啟(qi)動子(zi)(zi)，IPL的表達(da)(da)(da)受(shou)溫度調控(kong)。這些誘導(dao)(dao)型啟(qi)動子(zi)(zi)的可控(kong)性表達(da)(da)(da)，既(ji)可避免表達(da)(da)(da)產(chan)物(wu)(wu)對宿主前期生長(chang)的不利影響，又可減少基(ji)因表達(da)(da)(da)產(chan)物(wu)(wu)遭受(shou)蛋白酶的降(jiang)解作用(yong)，特別適(shi)合有毒蛋自(zi)的表達(da)(da)(da)。
③融合型表達 表(biao)達(da)載(zai)體的(de)多克隆位點上有(you)一段融合表(biao)達(da)標(biao)簽(qian)(qian)（tag），表(biao)達(da)為(wei)融合蛋(dan)白（N端(duan)融合或C端(duan)融合），可(ke)方便后續(xu)的(de)蛋(dan)白分離(li)純(chun)化或檢測。常見的(de)融合表(biao)達(da)標(biao)簽(qian)(qian)有(you)谷(gu)胱甘肽S轉移酶基因（GST）標(biao)簽(qian)(qian)或6×His標(biao)簽(qian)(qian)。對于特別小(xiao)的(de)目的(de)蛋(dan)自，使用分子質(zhi)量較大(da)的(de)GST標(biao)簽(qian)(qian)為(wei)好(hao)。
④分泌型表達 在起始密碼(ma)和目的(de)基因之間加入一個信號肽(tai)，可(ke)以引導目的(de)蛋白穿越細胞膜。可(ke)避免表達產(chan)(chan)物在細胞內過度積累而影響細胞的(de)生長(chang)，或(huo)者形成包含體，而且(qie)表達產(chan)(chan)物是(shi)可(ke)溶性的(de)，不需(xu)要復性。
由于原核生物和真(zhen)核生物存在糖基化、酰基化等翻譯后修(xiu)飾反應機制的(de)(de)差(cha)異，真(zhen)核基因的(de)(de)原核表達(da)(da)難以(yi)獲得有活性的(de)(de)蛋白，酵母成為了(le)真(zhen)核表達(da)(da)的(de)(de)首選(xuan)系統。
酵母表(biao)達載體(ti)多數(shu)從pBR322基(ji)本骨(gu)架衍生而(er)來，含有(you)該質(zhi)粒復制起始位點（ori），lacZ基(ji)因、bla或ampr、tetr等基(ji)因。啟(qi)動(dong)子有(you)GAP，AOX1、AUG1和(he)GAL1等.其中，GAP是組成型啟(qi)動(dong)子，AOX1，AUG1和(he)GAL1分(fen)別(bie)受甲醇、半乳糖和(he)維生素B1等誘導表(biao)達的誘導型啟(qi)動(dong)子。
酵(jiao)母表(biao)(biao)達載(zai)體(ti)多為穿梭載(zai)體(ti)，既(ji)可以在大腸桿(gan)菌中繁殖，獲得足夠的(de)載(zai)體(ti)DNA進行體(ti)外操作，又可以在酵(jiao)母中復制、表(biao)(biao)達和(he)選擇。
Ti質(zhi)粒(li)（tumor inducing plasmid）是(shi)根據農桿菌中發(fa)現的(de)可(ke)引發(fa)植物產生(sheng)冠癭瘤(liu)的(de)質(zhi)粒(li)。Ti質(zhi)粒(li)可(ke)分為T-DNA、Vir、Con 和Ori 4個功能區。
利(li)用(yong)T-DNA可(ke)攜帶外(wai)源DNA片(pian)段并整合(he)到植物(wu)基因(yin)組的特性，經(jing)對天然Ti質(zhi)粒(li)的改造，用(yong)于構建植物(wu)遺(yi)傳轉化(hua)的表(biao)(biao)達載體，分(fen)為一元表(biao)(biao)達載體和雙元表(biao)(biao)達載體等類型。
這類載(zai)體(ti)是由質粒作為基(ji)(ji)本骨架(jia)構(gou)建而成，帶有(you)原核復制區、選(xuan)擇(ze)性標記基(ji)(ji)因、啟動子、polyA尾信號序列、動物細胞中的選(xuan)擇(ze)基(ji)(ji)因[neor、胸苷激(ji)酶(mei)基(ji)(ji)因（tk）、綠色熒光蛋白基(ji)(ji)因（gfp）和腺(xian)嘌呤磷酸(suan)核糖(tang)轉移酶(mei)基(ji)(ji)因（aprt）]等(deng)有(you)關元件。山羊(yang)乳腺(xian)特(te)異性表(biao)達載(zai)體(ti)（pBC1）是典型的動物質粒表(biao)達載(zai)體(ti)。
病(bing)(bing)毒表達(da)載體是(shi)以病(bing)(bing)毒基(ji)因組序(xu)列(lie)為(wei)基(ji)礎(chu)，插入必(bi)要的(de)(de)表達(da)載體元件(jian)(jian)所(suo)構建(jian)成(cheng)的(de)(de)真核基(ji)因轉移工具(ju)。這些表達(da)載體元件(jian)(jian)有①源于病(bing)(bing)毒的(de)(de)啟動子和增強子；②病(bing)(bing)毒的(de)(de)復制子序(xu)列(lie)以及所(suo)需(xu)的(de)(de)反式作用因子編碼基(ji)因；③poly A加(jia)尾信號。
病毒表(biao)(biao)達載體可用于∶①外源蛋白(bai)的(de)真核表(biao)(biao)達；②基因治療；③多(duo)(duo)價、多(duo)(duo)聯活載體疫(yi)苗的(de)研制；④基因功能的(de)鑒(jian)定
重組型病毒載體
以完整的(de)(de)病(bing)毒基(ji)因組為(wei)改(gai)造對象，一方(fang)(fang)面(mian)選擇性地刪除病(bing)毒的(de)(de)某(mou)些必(bi)需(xu)基(ji)因，缺失的(de)(de)必(bi)需(xu)基(ji)因的(de)(de)功能由互(hu)補細(xi)胞反式(shi)(shi)提供；另一方(fang)(fang)面(mian)用(yong)(yong)外(wai)源(yuan)基(ji)因表達單位替代(dai)病(bing)毒非必(bi)需(xu)基(ji)因區；而病(bing)毒復制(zhi)和包裝所需(xu)的(de)(de)順(shun)式(shi)(shi)作(zuo)用(yong)(yong)元(yuan)件(jian)不變。這類載體一般通過(guo)同源(yuan)重(zhong)組方(fang)(fang)法將(jiang)外(wai)源(yuan)基(ji)因表達單位插入(ru)病(bing)毒基(ji)因組中。
無病毒基因的病毒載體
這(zhe)類載體系(xi)(xi)統(tong)往(wang)(wang)往(wang)(wang)由載體質粒(li)和輔助系(xi)(xi)統(tong)組成(cheng)。重(zhong)組載體質粒(li)主要由外源基因(yin)(yin)表達盒、病毒復制和包(bao)(bao)(bao)裝所必(bi)需的順式(shi)作(zuo)用(yong)元(yuan)件及質粒(li)骨(gu)架組成(cheng)。輔助系(xi)(xi)統(tong)包(bao)(bao)(bao)括(kuo)病毒復制和包(bao)(bao)(bao)裝所必(bi)需的所有(you)反式(shi)作(zuo)用(yong)元(yuan)件。在輔助系(xi)(xi)統(tong)的作(zuo)用(yong)下，重(zhong)組載體質粒(li)（包(bao)(bao)(bao)含或(huo)(huo)不包(bao)(bao)(bao)含質粒(li)骨(gu)架）以特定形式(shi)（單(dan)鏈或(huo)(huo)雙鏈，DNA或(huo)(huo) RNA）被包(bao)(bao)(bao)裝到病毒殼(ke)粒(li)中，其(qi)中不含有(you)任(ren)何病毒基因(yin)(yin)。
這類載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)的優點(dian)(dian)在于載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)病(bing)毒(du)(du)本身安全性好，容量大(da)；缺點(dian)(dian)在于往往需要輔(fu)(fu)助病(bing)毒(du)(du)參(can)與載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)DNA的包(bao)裝，而輔(fu)(fu)助病(bing)毒(du)(du)又難以同載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)病(bing)毒(du)(du)分離開來，造成最終(zhong)產品中輔(fu)(fu)助病(bing)毒(du)(du)污(wu)染，從而影響其(qi)應(ying)用(yong)。實(shi)際(ji)上，無病(bing)毒(du)(du)基(ji)因(yin)(yin)的病(bing)毒(du)(du)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)可以看作是重(zhong)組病(bing)毒(du)(du)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)的一種極(ji)端減毒(du)(du)情況。重(zhong)組AAV 載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)就(jiu)屬于無病(bing)毒(du)(du)基(ji)因(yin)(yin)的病(bing)毒(du)(du)載(zai)(zai)體(ti)(ti)(ti)(ti)。
腺(xian)病(bing)毒(du)是一種無包膜的(de)(de)雙(shuang)鏈(lian)DNA病(bing)毒(du)，在自然界中(zhong)廣泛分布(bu)。完整的(de)(de)病(bing)毒(du)顆粒為二十(shi)面(mian)體對稱結構(gou)，直徑70-100nm，衣(yi)殼含有(you)240個(ge)六鄰體（hexon）、12個(ge)五鄰體（penton）、12根纖毛（fiber）及一些小蛋白等。哺(bu)乳動物腺(xian)病(bing)毒(du)的(de)(de)基因組DNA長約36kb，基因組的(de)(de)兩(liang)端(duan)各(ge)有(you)約100bp的(de)(de)反向(xiang)末(mo)端(duan)重(zhong)復序列（ITR），ITR與(yu)末(mo)端(duan)蛋白（TP）相結合，與(yu)基因組復制及早期基因的(de)(de)轉錄有(you)關，ITR的(de)(de)內側為病(bing)毒(du)包裝信號Ψ，參(can)與(yu)腺(xian)病(bing)毒(du)基因組的(de)(de)衣(yi)殼化(hua)。
基(ji)于(yu)人血清5型腺病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)基(ji)因(yin)組(zu)結(jie)構，結(jie)合各基(ji)因(yin)的(de)(de)功能，科學(xue)家們開發了缺(que)失E1和E3基(ji)因(yin)的(de)(de)Ad5腺病(bing)(bing)(bing)毒(du)載(zai)體。E1基(ji)因(yin)在組(zu)裝(zhuang)感染性(xing)病(bing)(bing)(bing)毒(du)顆粒時(shi)必不可(ke)少，但是(shi)可(ke)以在HEK293包裝(zhuang)細胞中得到補充，而E3基(ji)因(yin)不影病(bing)(bing)(bing)毒(du)的(de)(de)包裝(zhuang)。由于(yu)E1和E3基(ji)因(yin)的(de)(de)缺(que)失，腺病(bing)(bing)(bing)毒(du)載(zai)體可(ke)插入高達7.5kb的(de)(de)外源基(ji)因(yin)。
腺病毒感染細胞的原理
腺(xian)病(bing)毒通(tong)過(guo)其(qi)纖毛蛋白C端的球狀結構域與細胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)特(te)(te)(te)異(yi)(yi)(yi)性受體（Ad5腺(xian)病(bing)毒特(te)(te)(te)異(yi)(yi)(yi)性識別細胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)的CAR受體；Ad5/F35腺(xian)病(bing)毒能特(te)(te)(te)異(yi)(yi)(yi)性識別細胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)的CD46受體）結合，同時病(bing)毒的五鄰體蛋白與細胞(bao)表(biao)(biao)面(mian)的整聯蛋白αvβ3和αvβ5相互作用，通(tong)過(guo)細胞(bao)內(nei)吞完成病(bing)毒的內(nei)化。
關于E1與E3基因
E1基(ji)(ji)因是(shi)一種早(zao)(zao)期最先啟(qi)動的基(ji)(ji)因，對于腺病(bing)(bing)毒其他早(zao)(zao)期基(ji)(ji)因的轉錄是(shi)必需的，因此(ci)缺失E1的腺病(bing)(bing)毒載體不(bu)能有效復制和產生各種病(bing)(bing)毒蛋白，從而不(bu)能完成病(bing)(bing)毒生活(huo)周(zhou)期。腺病(bing)(bing)毒的E3區編碼(ma)5-9個蛋白，主要(yao)功(gong)能都是(shi)幫(bang)助受染細胞逃逸機體免疫系(xi)統的識別和清除。
Ad5與Ad5/F35對比
Ad5腺病(bing)(bing)毒的(de)(de)高效感染依賴(lai)于靶(ba)(ba)細(xi)胞膜(mo)上(shang)的(de)(de)CAR和αvβ整(zheng)合素，但是一(yi)些免疫(yi)細(xi)胞的(de)(de)細(xi)胞膜(mo)上(shang)卻缺乏這些受體(ti)，如造(zao)血(xue)干細(xi)胞。這就使得研究人員尋找新(xin)的(de)(de)腺病(bing)(bing)毒血(xue)清(qing)型，最終發現F35血(xue)清(qing)型對造(zao)血(xue)干細(xi)胞有(you)很強的(de)(de)靶(ba)(ba)向性，因此，嵌合型Ad5/F35應用而生(sheng)。下面是Ad5 & Ad5/F35的(de)(de)結(jie)構示意圖和區別：
| 腺病毒種類 | 載體特點 | 功能 | 感染細胞受體 | 包裝系統 |
|---|---|---|---|---|
| AdV5 | 缺失E1和E3基因，允許插入長約8kb的外源基因 |
除(chu)免(mian)疫、血液類細胞外， 感染大(da)部分(fen)細胞 |
CAR | AdMax |
| AdV5/F35 |
一個嵌合型腺(xian)病毒載(zai)體(ti)，主要(yao)結構是(shi)在AdV5的(de)(de)(de)基礎上，其受(shou)體(ti)結合位置的(de)(de)(de)纖(xian)突(Fiber)改(gai)造(zao)成了F35型腺(xian)病毒(F35)的(de)(de)(de)纖(xian)突(纖(xian)毛蛋白的(de)(de)(de)Knob和shaft)。其細(xi)(xi)胞受(shou)體(ti)從(cong)AdV5的(de)(de)(de)CAR變成了CD46，其他的(de)(de)(de)基因仍舊保留AdV5載(zai)體(ti)的(de)(de)(de)特性，能有(you)效(xiao)(xiao)轉導CAR表達不足的(de)(de)(de)多種重要(yao)靶細(xi)(xi)胞，尤(you)其是(shi)對腫瘤(liu)細(xi)(xi)胞及造(zao)型干(gan)細(xi)(xi)胞、間充質(zhi)干(gan)細(xi)(xi)胞等有(you)較高的(de)(de)(de)感染(ran)效(xiao)(xiao)率。 |
理論上(shang)感(gan)染所有有細胞核的細胞 |
CD46 | AdMax |
腺相關病毒(du)(du)（Adeno-associated virus，AAV）是一種單鏈DNA復(fu)(fu)(fu)制缺(que)陷型(xing)細小(xiao)病毒(du)(du)，它(ta)的生命周期依賴(lai)于復(fu)(fu)(fu)制病毒(du)(du)的參(can)與。AAV基(ji)(ji)因(yin)(yin)組大小(xiao)為4.7 kb，由(you)末(mo)端反向(xiang)重復(fu)(fu)(fu)序列ITR和(he)中間的rep、cap基(ji)(ji)因(yin)(yin)組成。ITRs對于病毒(du)(du)的復(fu)(fu)(fu)制和(he)包裝具有(you)重要作(zuo)用；rep基(ji)(ji)因(yin)(yin)編碼參(can)與病毒(du)(du)復(fu)(fu)(fu)制、包裝和(he)基(ji)(ji)因(yin)(yin)組整合的非結構(gou)蛋(dan)(dan)白，cap基(ji)(ji)因(yin)(yin)編碼結構(gou)蛋(dan)(dan)白VP1、VP2和(he)VP3，3種蛋(dan)(dan)白分別按1:1:10的比例組裝形成病毒(du)(du)衣殼(ke)，充(chong)當病毒(du)(du)基(ji)(ji)因(yin)(yin)傳遞(di)載體。此外，cap基(ji)(ji)因(yin)(yin)內嵌套的另一個開放(fang)閱(yue)讀框編碼裝配(pei)激活(huo)蛋(dan)(dan)白AAP，參(can)與衣殼(ke)蛋(dan)(dan)白的靶向(xiang)和(he)裝配(pei)。
AAV轉導細(xi)(xi)胞(bao)主要經歷(li)了細(xi)(xi)胞(bao)表面受體(ti)(ti)介導的內(nei)吞、逃(tao)離內(nei)體(ti)(ti)、入核、脫衣殼和雙鏈轉化(hua)幾個過程。進入細(xi)(xi)胞(bao)后，可以(yi)在輔助病(bing)毒的存在下進入其復制周期。
重(zhong)組AAV載(zai)體(ti)可以(yi)通過將內(nei)源性的rep和(he)cap基(ji)(ji)因替換為一個(ge)表達盒，該(gai)表達盒由(you)一個(ge)啟動(dong)子(zi)驅動(dong)一個(ge)感(gan)興趣的轉基(ji)(ji)因和(he)一個(ge)poly（A）尾巴(ba)組成。通過包(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)質粒(li)(li)反(fan)式提供rep和(he)cap基(ji)(ji)因以(yi)及腺(xian)病(bing)毒(du)輔(fu)助(zhu)質粒(li)(li)來(lai)包(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)載(zai)體(ti)。病(bing)毒(du)編碼(ma)序(xu)列的完全(quan)去(qu)除使AAV的包(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)能力最大化（包(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)(zhuang)容量為4.5Kb），并且(qie)有助(zhu)于它們(men)在體(ti)內(nei)遞送(song)時的低免疫原(yuan)性和(he)細胞毒(du)性。
基因工程化(hua)的AAV能轉(zhuan)導外源基因，借助特定啟動子、光遺傳(chuan)學/化(hua)學遺傳(chuan)學元件、鈣指示劑、神經遞(di)質(zhi)探針或Cre/lox P，Flp／FRT重(zhong)組酶(mei)技術，可選擇(ze)性(xing)地標(biao)記特定的神經元。重(zhong)組AAV基因傳(chuan)遞(di)效果好(hao)、缺乏致病性(xing)和安全性(xing)高、宿主細胞范圍廣、在體(ti)內表達時間長，是目前最有前途和最成(cheng)功的基因治療載體(ti)之一。
現(xian)階段研究人員已(yi)發現(xian)12種(zhong)人類AAV 血(xue)(xue)清型(xing)（AAV1至AAV12）和(he) 100多種(zhong)非人類靈長動物AAV血(xue)(xue)清型(xing)。不(bu)(bu)同AAV血(xue)(xue)清型(xing)具有不(bu)(bu)同的衣(yi)殼(ke)蛋白空間(jian)結構(gou)、序列和(he)組織(zhi)特異性，因(yin)而其識別(bie)與結合(he)的細(xi)(xi)胞表面受體也相(xiang)應有很(hen)大差別(bie)，這也導(dao)致不(bu)(bu)同血(xue)(xue)清型(xing)轉染(ran)的組織(zhi)類型(xing)、細(xi)(xi)胞類型(xing)和(he)感染(ran)效率也各不(bu)(bu)相(xiang)同。
已批準(zhun)用于商(shang)業用途的：AAV1和AAV2；
臨床使用(yong)頻(pin)率最高的(de)：AAV2；AAV8，AAV9，AAVRh10；
AAV8，AAV9：靶向全身的多種肌肉類(lei)型；
幾乎所(suo)有天(tian)然(ran)AAV衣殼都可以在全身給藥后有效地轉到肝(gan)臟；
| Serotype | Glycan recognitiona | Coreceptor |
|---|---|---|
| AAV1 | Neu5Aca2-3GalNAcβ1-4GlcNAc | Unknown |
| AAV2 | 6-O-and N-sulfated heparin |
Fibroblast / hepatocyte growth factor receptor; laminin receptor; integrin αVβ5 and α5β1 |
| AAV3 | 2-O-and N-sulfated heparin | Hepatocyte growth factor receptor; Laminin receptor |
| AAV4 | Galβ1-4GlcNAcβ1-2Manα1-6Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAc | Unknown |
| AAV5 | Neu5Acα2-3(6S)Galβ1-4GlcNAc | Platelet-derived growth factor receptor |
| AAV6 | Neu5Acα2-3GalNAcβ1-4GlcNAc; N-sulfated heparin | Epidermal growth factor recepto |
| AAV7 | Unknown | Unknown |
| AAV8 | Unknown | Laminin receptor |
| AAV9 | Galactose | Laminin receptor |
| Tissue | Optimal Serotype |
|---|---|
| CNS | AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8，AAV9 |
| Heart |
AAV1，AAV8，AAV9 |
| Kidney | AAV2 |
| Liver | AAV7，AAV8，AAV9 |
| Lung | AAV4，AAV5，AAV6，AAV9 |
| Pancreas | AAV8 |
| Photoreceptor Cells | AAV2，AAV5，AAV8 |
| RPE(Retinal Pigment Epithelium) | AAV1，AAV2，AAV4，AAV5，AAV8 |
| Skeletal Muscle | AAV1，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9 |
1. 局部注(zhu)射，直接在(zai)想(xiang)表達的地方(fang)注(zhu)射 rAAV ，適合器(qi)官水平(ping)特異感染，容易操作。
2. 使用組(zu)織/器(qi)官特異啟動子來表(biao)達外(wai)源基因(yin)包裝 rAAV， rAAV 即使感(gan)染了(le)其(qi)(qi)他組(zu)織也由于特異性啟動子而不會(hui)在其(qi)(qi)他組(zu)織中表(biao)達。
3.Cre-on，Flex，DIO，double floxed :使用(yong) Cre-Loxp 系統，經過(guo)兩(liang)次染色體重組在特(te)定(ding)臟器(qi)中表達(da)外源基因。
目前，研究人員常用(yong)的(de)(de)(de)(de)兩類AAV分別為single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是(shi)基于(yu)2個基礎(chu)被開發的(de)(de)(de)(de)：一個是(shi)理(li)論(lun)基礎(chu)：無論(lun)scAAV還是(shi)rAAV，病毒顆粒(li)中均可(ke)包裹(guo)二倍體，甚至四倍體的(de)(de)(de)(de)AAV基因組DNA；一個是(shi)結構基礎(chu)：wtAAV ITR序(xu)列的(de)(de)(de)(de)特殊性(T型結構)。ssAAV包裝基因組正義(yi)鏈(lian)(lian)和反義(yi)鏈(lian)(lian)的(de)(de)(de)(de)幾率一樣。ssAAV在入(ru)(ru)核、脫衣殼后(hou)，需要借(jie)助(zhu)宿主DNA聚(ju)合酶或者(zhe)分子間退火完成雙鏈(lian)(lian)轉(zhuan)(zhuan)化，才能啟動基因轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)過程，而scAAV中已存在雙鏈(lian)(lian)，它入(ru)(ru)核后(hou)即可(ke)啟動基因轉(zhuan)(zhuan)錄(lu)(lu)，跨過了雙鏈(lian)(lian)轉(zhuan)(zhuan)化的(de)(de)(de)(de)步驟，從而實(shi)現(xian)外源基因的(de)(de)(de)(de)快速表達(da)。
ssAAV和scAAV向靶細胞中遞(di)送外源基因的過程：
慢(man)(man)病毒(du)屬(shu)于逆(ni)轉錄病毒(du)科，能夠感(gan)染分(fen)(fen)裂和(he)非分(fen)(fen)裂的(de)細胞，從而將(jiang)(jiang)它(ta)們與普通的(de)逆(ni)轉錄病毒(du)區(qu)別(bie)開來。慢(man)(man)病毒(du)基(ji)因組由兩(liang)個拷貝的(de)單鏈(lian)RNA組成(cheng)，并被結構蛋白(bai)(bai)和(he)酶(mei)蛋白(bai)(bai)包(bao)裹在衣殼中(zhong)，這些(xie)結構蛋白(bai)(bai)和(he)酶(mei)蛋白(bai)(bai)包(bao)括逆(ni)轉錄酶(mei)（將(jiang)(jiang)RNA轉化(hua)為(wei)dsDNA）和(he)DNA整(zheng)合酶(mei)（將(jiang)(jiang)dsDNA整(zheng)合到宿主基(ji)因組中(zhong)）。
如上圖步驟｜，用包(bao)(bao)膜(mo)、轉移(yi)和包(bao)(bao)裝載(zai)(zai)體(ti)轉染慢(man)病(bing)毒(du)包(bao)(bao)裝細胞系。包(bao)(bao)膜(mo)、轉移(yi)和包(bao)(bao)裝載(zai)(zai)體(ti)轉錄(lu)的mRNA分(fen)別被(bei)翻譯成：通(tong)過內質網進入(ru)細胞膜(mo)的病(bing)毒(du)包(bao)(bao)膜(mo)蛋白（2a）；單鏈RNA病(bing)毒(du)基因組(zu)（2b）；病(bing)毒(du)結構蛋白和酶(mei)（2c），這三(san)種成分(fen)組(zu)裝成病(bing)毒(du)顆粒，從宿主(zhu)細胞膜(mo)上出芽。
如上(shang)圖步驟(zou)‖，病(bing)毒(du)顆粒通過包膜(mo)蛋(dan)白(bai)附著(zhu)在宿(su)(su)主(zhu)細胞表面受(shou)體上(shang)，病(bing)毒(du)與宿(su)(su)主(zhu)質膜(mo)融合釋放(fang)結構蛋(dan)白(bai)、酶(mei)蛋(dan)白(bai)和病(bing)毒(du)基因組。病(bing)毒(du)RNA被逆轉(zhuan)錄成雙鏈DNA，并與整合酶(mei)形成預整合復合物，整合酶(mei)通過核孔復合物，催化病(bing)毒(du)DNA整合到宿(su)(su)主(zhu)基因組中，最后(hou)轉(zhuan)移載(zai)體啟(qi)動(dong)子(zi)驅(qu)動(dong)轉(zhuan)基因表達。
人類免疫缺陷病(bing)(bing)毒-1型(xing)（HIV-1）作為(wei)典(dian)型(xing)的(de)慢病(bing)(bing)毒，其基因(yin)Gag、Pol和(he)Env分(fen)別編(bian)碼結構核(he)心蛋白、逆轉錄酶和(he)整(zheng)合酶以及包(bao)膜糖(tang)蛋白；Tat和(he)Rev參(can)與(yu)病(bing)(bing)毒復制：Tat啟動(dong)病(bing)(bing)毒基因(yin)組(zu)轉錄，并(bing)(bing)受(shou)(shou)長末(mo)端重(zhong)復序(xu)列(lie)驅動(dong)，Rev促(cu)進(jin)(jin)病(bing)(bing)毒mRNA的(de)核(he)輸出，并(bing)(bing)受(shou)(shou)到Rev響應元件的(de)調控(kong)；包(bao)裝信號(Ψ)是將(jiang)病(bing)(bing)毒基因(yin)組(zu)進(jin)(jin)入衣殼的(de)關鍵。此外(wai)，HIV-1基因(yin)組(zu)中(zhong)包(bao)含(han)的(de)毒力(li)因(yin)子Vif、Vpr、Vpu和(he)Nef會(hui)干擾(rao)宿主防御機(ji)制，并(bing)(bing)包(bao)含(han)在組(zu)裝好的(de)病(bing)(bing)毒粒子中(zhong)。（圖2）
慢病毒是以HIV-1為基礎發展起來的基因治療載體。
第(di)一(yi)代慢病毒載(zai)體將所有包裝元件編(bian)碼(ma)在一(yi)個(ge)載(zai)體上，生(sheng)物安(an)全風(feng)險較(jiao)高；
第二(er)代慢病毒(du)載(zai)體去除(chu)了毒(du)力因(yin)子(zi)(zi)并(bing)將包膜從包裝載(zai)體中分離，提高了安全性并(bing)增強了病毒(du)復制，而不干擾有功能的病毒(du)粒子(zi)(zi)的生產。此外，3’LTR包含U3缺失，可以消除(chu)病毒(du)基因(yin)組(zu)復制的啟動子(zi)(zi)活性，并(bing)在不影響病毒(du)粒子(zi)(zi)滴(di)度(du)或轉基因(yin)表達(da)的情況下自滅活載(zai)體。
第三代慢病毒載(zai)體(ti)(ti)(ti)從包裝載(zai)體(ti)(ti)(ti)中去(qu)除Rev，并用轉移載(zai)體(ti)(ti)(ti)上(shang)游(you)的一個組成啟動(dong)子替換(huan)Tat，是目前被廣泛應用的慢病毒包裝載(zai)體(ti)(ti)(ti)。（圖3）
引物(wu)(wu)是指在PCR反應中(zhong)(zhong)與(yu)待擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)靶DNA區(qu)段兩(liang)翼互(hu)補的(de)寡聚核苷酸，其本質(zhi)是單(dan)鏈 DNA片段。PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)產物(wu)(wu)的(de)大(da)小及擴(kuo)(kuo)增(zeng)的(de)靶序(xu)列在基(ji)因(yin)組中(zhong)(zhong)的(de)位置是由引物(wu)(wu)限定的(de)，因(yin)此，引物(wu)(wu)的(de)選擇對PCR 成功(gong)與(yu)否具(ju)有決定性(xing)意義。引物(wu)(wu)設計質(zhi)量(liang)是影(ying)響PCR擴(kuo)(kuo)增(zeng)成敗的(de)關鍵因(yin)素，一般要考慮以下幾(ji)個問題：
① 引(yin)物(wu)(wu)長度一(yi)(yi)般16~30 bp為宜、20~24 bp為佳。引(yin)物(wu)(wu)長度較短一(yi)(yi)般會降低擴增特異性，但會提高(gao)有效性，擴增的產物(wu)(wu)種類會增多。
② G+C含量一般為40%~60%為佳，兩條引(yin)物(wu)G+C含量應盡(jin)量相似(si)，Tm最好接近，差(cha)異最好在1℃以內，最多不超過5℃。
③ 兩個(ge)(ge)引物(wu)之間不應(ying)發生互(hu)補，特別應(ying)避免(mian)形成(cheng)"引物(wu)二聚體"，如果無(wu)法避免(mian)，其(qi)(qi)3'端互(hu)補不應(ying)大于2個(ge)(ge)堿(jian)基，應(ying)盡量(liang)避免(mian)數個(ge)(ge)嘌呤(ling)或嘧(mi)啶連續排列(lie)，避免(mian)同源(yuan)序列(lie)（尤其(qi)(qi) 6個(ge)(ge)堿(jian)基以上(shang)相同）。
④ 引(yin)物(wu)內部避(bi)免形成次級結(jie)構，尤(you)其發卡結(jie)構，若用人工判斷(duan)，引(yin)物(wu)自身連續(xu)互(hu)補堿(jian)基不能(neng)大于(yu)3bp，必(bi)要時應通過(guo)計(ji)算機(ji)進行結(jie)構分析。
⑤ 引物(wu)的(de)延(yan)伸(shen)從3'端開始，3'端不能(neng)進行任何修飾，也不能(neng)有形成任何二(er)級結(jie)構的(de)可能(neng)，3'末端最后1個堿基最好是G或C。
⑥ 引物的5'端限(xian)定著PCR產(chan)物的長度(du)，對擴(kuo)增特異性影響(xiang)不(bu)大，因此，5'端可以被(bei)修(xiu)飾而(er)不(bu)影響(xiang)擴(kuo)增的特異性。
⑦ 引物3'端不要終(zhong)止于編碼區城密碼子的(de)第3位，因密碼子的(de)第3位易發(fa)生簡并，會影響擴增(zeng)特(te)異性與效(xiao)率(lv)。
引(yin)(yin)物設(she)計(ji)可借助于(yu)一些計(ji)算機引(yin)(yin)物設(she)計(ji)軟(ruan)件(jian)方便地進行。目(mu)前(qian)用于(yu)引(yin)(yin)物設(she)計(ji)的欽件(jian)有(you)多(duo)種，其中Oligo6、Prmer5.0是非常(chang)方便且功能(neng)強大的引(yin)(yin)物設(she)計(ji)分析軟(ruan)件(jian)。
聚合酶鏈(lian)式反應(ying)（polymerase chain reaction，PCR）是 Kary M u l l i s 于1985年發明的(de)(de)(de)核(he)酸體外擴增技術，是分(fen)子克隆研(yan)究中(zhong)不(bu)可(ke)或缺的(de)(de)(de)基本技術。隨著分(fen)子生物學的(de)(de)(de)發展，人們在(zai)PCR基本技術的(de)(de)(de)基礎上(shang)，不(bu)斷(duan)地推(tui)陳(chen)出(chu)新，發展了多種PCR延伸技術（反轉錄PCR、錨定(ding)PCR、巢式 PCR、實時(shi)定(ding)量PCR等等），以適應(ying)不(bu)同的(de)(de)(de)用途。
在(zai)有DNA單(dan)(dan)鏈(lian)、與DNA單(dan)(dan)鏈(lian)互補(bu)的(de)寡核苷酸引物、dNTPs及DNA聚(ju)合(he)酶的(de)情況(kuang)下(xia)(xia)，引物與單(dan)(dan)鏈(lian)的(de)互補(bu)區結合(he)后，在(zai)DNA聚(ju)合(he)酶的(de)催化作用(yong)下(xia)(xia)即可(ke)進行DNA單(dan)(dan)鏈(lian)的(de)5'→3'合(he)成反應。通過特殊的(de)儀器不(bu)斷滿(man)足上述條(tiao)(tiao)件(jian)，則DNA單(dan)(dan)鏈(lian)的(de)5'→3'合(he)成反應可(ke)不(bu)斷進行下(xia)(xia)去(qu)，直(zhi)到條(tiao)(tiao)件(jian)不(bu)復存在(zai)，實質上是模擬天(tian)然DNA的(de)復制(zhi)過程(cheng)。
PCR包括三個(ge)基本(ben)過程：變性(xing)、退(tui)火(huo)和延(yan)伸。
①變(bian)(bian)性(xing)（denaturation）：92~96℃的高溫處理可(ke)使(shi)模(mo)板(ban)DNA雙鏈間(jian)氫鍵斷(duan)裂，解離成單(dan)鏈但不改變(bian)(bian)其化(hua)學性(xing)質，變(bian)(bian)性(xing)的時間(jian)一般為30 s，如果模(mo)板(ban)的G+C含量較高，變(bian)(bian)性(xing)時間(jian)可(ke)適當延長。
②退火(huo)（annealing）：將溫(wen)(wen)度降低(di)到55℃左右，使引(yin)(yin)物(wu)與(yu)模(mo)(mo)板的互(hu)補(bu)區結(jie)合。退火(huo)的溫(wen)(wen)度取決于引(yin)(yin)物(wu)的Tm值，并通(tong)過預(yu)備試(shi)驗(yan)最終確定。一般(ban)引(yin)(yin)物(wu)越(yue)(yue)(yue)短(duan)，其Tm值也越(yue)(yue)(yue)低(di)，反之則高。退火(huo)溫(wen)(wen)度越(yue)(yue)(yue)高，引(yin)(yin)物(wu)與(yu)模(mo)(mo)板結(jie)合的特異(yi)性(xing)增強，非(fei)特異(yi)性(xing)的擴增概(gai)率(lv)降低(di)，但擴增效率(lv)也隨(sui)之降低(di)。相反，隨(sui)著溫(wen)(wen)度的降低(di)，引(yin)(yin)物(wu)與(yu)模(mo)(mo)板的非(fei)特異(yi)性(xing)結(jie)合的概(gai)率(lv)提高。退火(huo)的時(shi)間一般(ban)為(wei)30s。
③延(yan)伸（extension）：在72℃溫度(du)下，DNA聚合(he)酶將dNTPs連續加到引物(wu)的(de)3'-OH端，以互補的(de)DNA單(dan)鏈(lian)為(wei)模板，沿著模板延(yan)伸合(he)成模板 DNA的(de)互補鏈(lian)，稱為(wei)延(yan)伸。延(yan)伸的(de)時間由擴增(zeng)產物(wu)的(de)大小決(jue)定，一般每1kb延(yan)伸1min。
這三個(ge)(ge)過程組成一個(ge)(ge)循環周(zhou)期，每個(ge)(ge)周(zhou)期合成的產物(wu)又可(ke)作為下一個(ge)(ge)周(zhou)期的模板，如此循環往復，經過n輪循環后(hou)，靶DNA的拷貝數理論上(shang)呈2n增(zeng)長。
PCR反應經過一定數量的循(xun)環(huan)后(hou)，隨著(zhu)產物的對數累(lei)積趨于(yu)飽(bao)和(he)，DNA片(pian)段不再呈指數積累(lei)，而(er)是進入線性增(zeng)長期或靜止期，此(ci)過程稱為(wei)平(ping)臺(tai)效應（plateau effect）。
平臺(tai)期與(yu)(yu)下列因素有關：①隨著引物、dNTP 快速摻入底物中，它們的(de)濃度(du)降低，摻入速度(du)減慢；②隨產(chan)物增加，酶與(yu)(yu)模(mo)板(ban)的(de)比例下降；③非特異性(xing)產(chan)物或引物二(er)聚體與(yu)(yu)反應物的(de)競(jing)爭(zheng)；④產(chan)物的(de)再結合(he)。
PCR反應需要一定(ding)的條件才能完成(cheng)，這(zhe)些條件主要有以下方面：
（一）緩沖液
任何一(yi)(yi)個生化反應都必(bi)須(xu)在一(yi)(yi)定的(de)緩(huan)沖體(ti)系(xi)中(zhong)(zhong)(zhong)進行(xing)，緩(huan)沖體(ti)系(xi)除了提(ti)(ti)供一(yi)(yi)定的(de)pH緩(huan)沖能(neng)力(li)外，還(huan)有(you)一(yi)(yi)些(xie)有(you)助于反應進行(xing)的(de)成分。PCR反應緩(huan)沖液(ye)通常采(cai)(cai)用(yong)10 mmol/L Tris-HCl（pH 8.3-9.0，室溫）緩(huan)沖液(ye)體(ti)系(xi)，其中(zhong)(zhong)(zhong)含有(you)可激活(huo)(huo)DNA聚(ju)合(he)酶(mei)的(de)活(huo)(huo)性中(zhong)(zhong)(zhong)心的(de)二(er)價陽離子，一(yi)(yi)般采(cai)(cai)用(yong)Mg2+，以MgCl2的(de)形式提(ti)(ti)供，Mg2+的(de)濃(nong)度高(gao)低可顯著影響 PCR擴增產物(wu)的(de)特異性，此外，緩(huan)沖液(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)還(huan)含有(you)50 mmol/L的(de)K+，有(you)利于引物(wu)與(yu)模(mo)板的(de)退火。有(you)些(xie)緩(huan)沖液(ye)中(zhong)(zhong)(zhong)還(huan)加(jia)入明膠或(huo)血清白(bai)蛋白(bai)（100 μg/mL）及去污(wu)劑（如Twcen20 等(deng)），對(dui)Taq DNA聚(ju)合(he)酶(mei)起穩定作用(yong)。
（二）模板
PCR模板(ban)是含有待(dai)擴(kuo)增(zeng)序列的(de)(de) DNA、mRNA或cDNA等，模板(ban)數(shu)量可直接影響擴(kuo)增(zeng)的(de)(de)效(xiao)(xiao)果。對于一(yi)般(ban)的(de)(de) PCR擴(kuo)增(zeng)，104～107個模板(ban)分子(zi)可達(da)到(dao)滿意的(de)(de)效(xiao)(xiao)果，一(yi)般(ban)宜用納克(ke)（ng）級的(de)(de)克(ke)隆(long)DNA、微克(ke)（μg）水平的(de)(de)染(ran)(ran)(ran)色體DNA或102～105拷貝待(dai)擴(kuo)增(zeng)的(de)(de)DNA片段作(zuo)為起(qi)始材(cai)料。除了數(shu)量外，模板(ban)的(de)(de)質(zhi)量也非常重要，不(bu)能有太(tai)多的(de)(de)蛋白(bai)質(zhi)和(he)其他(ta)污(wu)染(ran)(ran)(ran)，特別是其他(ta)DNA的(de)(de)污(wu)染(ran)(ran)(ran)，即使(shi)是痕量的(de)(de)DNA，也會導(dao)致非特異性(xing)產物(wu)。
（三）dNTP
dNTP是dATP、dTTP、dGTP、dCTP的(de)總稱。貯(zhu)備液(ye)為(wei)pH 7.0 左右，其濃(nong)(nong)度(du)一般為(wei)20 mmol，-20℃保(bao)存(cun)。體(ti)系中(zhong)(zhong)為(wei)20~200 μmol即(ji)可(ke)，過低則(ze)反應速(su)度(du)下降，濃(nong)(nong)度(du)過高則(ze)特異性下降，因為(wei)dNTP能絡合溶(rong)液(ye)中(zhong)(zhong)的(de)Mg2+，產生錯配或抑制Taq DNA聚合酶活(huo)性。
（四）耐熱的DNA聚合酶
PCR反應(ying)中使(shi)用(yong)(yong)的 DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)必須耐高溫(wen)，在90℃以(yi)上(shang)的高溫(wen)下仍(reng)能有(you)活性，正是由于耐熱(re)DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)的應(ying)用(yong)(yong)才使(shi) PCR技術(shu)得以(yi)實現，目前(qian)使(shi)用(yong)(yong)的耐高溫(wen)DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)主要有(you)Taq DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)、Tth DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)、Vent DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)、Pfu DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)和Pwo DNA聚(ju)合(he)(he)酶(mei)(mei)(mei)等。
（五）引物
根據大(da)量的研究(jiu)報道，PCR反應(ying)的最佳條件為(wei)：①Taq DNA聚(ju)合酶的濃度為(wei)1.0-2.5 U/100μL反應(ying)液；②dNTP的濃度為(wei)20～200 μmol/L；③Mg2+濃度為(wei)0.5～2.5 mmol/L；④引物的濃度為(wei)0.2～1.0 μmol/L。在(zai)準備具體的PCR反應(ying)時，還要針對模板特性、PCR儀等進行(xing)上述(shu)反應(ying)體系的優(you)化(hua)，并(bing)設置試(shi)驗確定連退火(huo)溫度、延伸時間，建立其相應(ying)的PCR反應(ying)最優(you)程序(xu)。
在PCR過程中，研(yan)究人員通常會在PCR反(fan)應(ying)體系中添加二甲(jia)基亞砜DMSO，那(nei)么(me)它究竟有什(shen)么(me)作用呢？機理是什(shen)么(me)呢？
通常我們可以這么理解：DMSO主要用于高GC含量的模板擴增，可能的機理是改善GC含量高的DNA的變形情況，降低其二級結構，使得聚合酶在二級結構處延伸。DMSO可以提高PCR的特異性,幫助擴增一些難擴的模板。當體系中加入(ru)DMSO時，可適當降低退火溫度。
延伸閱讀
在實踐中，聚合酶鏈式反應可能因各種原因而失敗，通常表現為兩個問題，一是目的模板的擴增量太少，二是非目的基因擴增太多。這種情況話，研究人員通常會在反應體系中加入合適的添加劑進行解決。通常添加劑的作用主要是降低基因的二級結構或者降低非特異性的啟動。下面是幾種常用的添加劑以及它們的作用：
① 二甲基亞(ya)砜DMSO、非離子性(xing)洗滌劑、甜(tian)菜堿(jian)——可(ke)以(yi)降低(di)DNA二級結構
② 甲酰胺、四甲基(ji)氯化銨TMAC——降低(di)非特(te)異性啟(qi)動
③ 鎂離子——聚(ju)合酶不可缺少的一個(ge)輔因子
④ 牛(niu)血(xue)清(qing)白(bai)蛋(dan)白(bai)——減(jian)少(shao)污(wu)染(ran)物
一(yi)般而(er)言，常規PCR很難通過(guo)基(ji)因(yin)擴增產物來(lai)定量(liang)該基(ji)因(yin)在模板中(zhong)的表達，而(er)實時(shi)定量(liang)PCR（real-time quantitative PCR）則可解決(jue)這(zhe)一(yi)問題。所謂(wei)實時(shi)定量(liang)PCR技術，是指在PCR反應體系(xi)中(zhong)加入熒光(guang)(guang)基(ji)團，利用熒光(guang)(guang)信號積累實時(shi)監測整個PCR進(jin)程，最后通過(guo)標準曲線對模板中(zhong)特定基(ji)因(yin)進(jin)行定量(liang)分析的方法。
熒光擴增曲線可以分成三個階段∶熒光背景信號階段、熒光信號指數擴增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產物量的變化；在平臺期，擴增產物已不再呈指數級增加，PCR產物量與起始模板量之間沒有線性關系，無法根據最終PCR產物量算出起始DNA拷貝數。只有在熒光信號指數擴增階段，PCR產物量(liang)的對數值(zhi)與(yu)起始模板(ban)量(liang)之間存在線性(xing)關系，可(ke)以選擇在這個階段進行定量(liang)分析。
①臨界點選擇。臨界點是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值。它可以設定在熒光信號指數擴增階段任意位置上，但一般將臨界點缺省設置為3-15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍；②臨界點循環數（threshold cycle，Tc或Ct），PCR反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數稱為臨界點循環數，模板的Ct值與模板的起始拷貝數的對數存在線性關系，起始拷貝數越多，Ct值越小；③標準曲線繪制。利用已知起始(shi)拷(kao)貝數(shu)(shu)(shu)的標準(zhun)品(pin)可繪制標準(zhun)由線，其中橫坐(zuo)標代(dai)表起始(shi)拷(kao)貝數(shu)(shu)(shu)的對(dui)數(shu)(shu)(shu)，縱坐(zuo)標代(dai)表Ct值。因此，只要獲(huo)得未知樣品(pin)的Ct值，即可從標準(zhun)曲線上推(tui)算出該(gai)樣品(pin)的起始(shi)拷(kao)貝數(shu)(shu)(shu)。
探(tan)針類(lei)和非探(tan)針類(lei)實時定量PCR的化學原理有(you)所不同。探(tan)針類(lei)是(shi)(shi)利(li)用與靶(ba)序(xu)列特異(yi)雜交(jiao)的探(tan)針來指示(shi)擴增(zeng)(zeng)產物的增(zeng)(zeng)加；非探(tan)針類(lei)則是(shi)(shi)利(li)用熒光染料或(huo)者(zhe)特殊設計的引物來指示(shi)擴增(zeng)(zeng)產物的增(zeng)(zeng)加。前(qian)者(zhe)由于增(zeng)(zeng)加了探(tan)針的識別步驟，特異(yi)性(xing)更高，但(dan)后者(zhe)則簡便(bian)易行。
①TaqMan熒(ying)光(guang)(guang)探針(zhen) PCR擴(kuo)(kuo)增時在(zai)加入一對引物(wu)(wu)的(de)同時，也(ye)加入一個(ge)(ge)特異性寡核(he)苷(gan)酸熒(ying)光(guang)(guang)探針(zhen)，其兩端分別(bie)標(biao)記了一個(ge)(ge)報(bao)告(gao)熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)(ji)團和一個(ge)(ge)淬滅(mie)(mie)熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)(ji)團。在(zai)探針(zhen)完整(zheng)的(de)情況下，報(bao)告(gao)基(ji)(ji)團發射的(de)熒(ying)光(guang)(guang)信號會被淬滅(mie)(mie)基(ji)(ji)團吸收；PCR擴(kuo)(kuo)增時，Taq DNA酶(mei)的(de)5'-3'核(he)酸外切酶(mei)活性將探針(zhen)酶(mei)切降(jiang)解，使報(bao)告(gao)熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)(ji)團和淬滅(mie)(mie)熒(ying)光(guang)(guang)基(ji)(ji)團分離，熒(ying)光(guang)(guang)監測系統(tong)可接收到(dao)熒(ying)光(guang)(guang)信號，即每擴(kuo)(kuo)增一條DNA鏈，就有一個(ge)(ge)熒(ying)光(guang)(guang)分子形成(cheng)，實現了熒(ying)光(guang)(guang)信號的(de)累積與(yu)PCR產物(wu)(wu)形成(cheng)完全(quan)同步。
②SYBR熒(ying)光(guang)(guang)染(ran)料(liao) 在PCR反(fan)應體系(xi)中(zhong)，加入過量SYBR熒(ying)光(guang)(guang)染(ran)料(liao)，SYBR熒(ying)光(guang)(guang)染(ran)料(liao)特異性地摻入DNA 雙鏈(lian)后，發(fa)射熒(ying)光(guang)(guang)信(xin)號，而(er)不摻入鏈(lian)中(zhong)的(de)SYBR 染(ran)料(liao)分子(zi)不會發(fa)射任(ren)何熒(ying)光(guang)(guang)信(xin)號，從(cong)而(er)保證熒(ying)光(guang)(guang)信(xin)號的(de)增加與(yu)PCR產物的(de)增加完全同步。
實時熒光(guang)定(ding)量PCR技術(shu)是DNA定(ding)量技術(shu)的(de)一次(ci)飛躍，運用該技術(shu)可進行(xing)基因(yin)表達、基因(yin)型鑒定(ding)、DNA或RNA的(de)絕對定(ding)量等領域的(de)分析。
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