關于AAV載體

腺相關病毒載體（一）

腺(xian)相關(guan)病(bing)(bing)毒(du)(du)（Adeno-associated virus，AAV）是(shi)一種單(dan)鏈DNA復(fu)制(zhi)缺陷型細小病(bing)(bing)毒(du)(du)，它的(de)生命(ming)周期依賴(lai)于復(fu)制(zhi)病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)參(can)與。AAV基(ji)(ji)(ji)因組大(da)小為4.7 kb，由(you)末端反向重復(fu)序列ITR和中(zhong)間(jian)的(de)rep、cap基(ji)(ji)(ji)因組成。ITRs對于病(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)復(fu)制(zhi)和包(bao)裝(zhuang)具有重要作(zuo)用；rep基(ji)(ji)(ji)因編碼(ma)參(can)與病(bing)(bing)毒(du)(du)復(fu)制(zhi)、包(bao)裝(zhuang)和基(ji)(ji)(ji)因組整合的(de)非結構(gou)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)，cap基(ji)(ji)(ji)因編碼(ma)結構(gou)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)VP1、VP2和VP3，3種蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)分別按1:1:10的(de)比例(li)組裝(zhuang)形(xing)成病(bing)(bing)毒(du)(du)衣殼，充當病(bing)(bing)毒(du)(du)基(ji)(ji)(ji)因傳遞載體。此外，cap基(ji)(ji)(ji)因內嵌(qian)套的(de)另一個開放閱讀框(kuang)編碼(ma)裝(zhuang)配激活蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)AAP，參(can)與衣殼蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)的(de)靶向和裝(zhuang)配。

AAV轉導細(xi)胞(bao)主要經歷了(le)細(xi)胞(bao)表面受體介導的(de)內(nei)吞、逃離內(nei)體、入(ru)核(he)、脫衣殼和雙(shuang)鏈轉化幾個(ge)過程(cheng)。進入(ru)細(xi)胞(bao)后(hou)，可以(yi)在輔(fu)助病毒的(de)存在下進入(ru)其復制周期(qi)。 

AAV轉導細胞過程

重(zhong)組(zu)AAV載(zai)體(ti)可以通過將(jiang)內(nei)源性的(de)rep和cap基因(yin)替換為一(yi)(yi)個表達盒，該表達盒由一(yi)(yi)個啟(qi)動子驅動一(yi)(yi)個感興趣(qu)的(de)轉基因(yin)和一(yi)(yi)個poly（A）尾巴(ba)組(zu)成。通過包(bao)(bao)裝質(zhi)粒反式(shi)提(ti)供rep和cap基因(yin)以及(ji)腺(xian)病(bing)(bing)毒輔助質(zhi)粒來包(bao)(bao)裝載(zai)體(ti)。病(bing)(bing)毒編碼序列的(de)完(wan)全去(qu)除使AAV的(de)包(bao)(bao)裝能力最大化（包(bao)(bao)裝容(rong)量為4.5Kb），并(bing)且有助于它們在體(ti)內(nei)遞送時的(de)低免(mian)疫原性和細(xi)胞毒性。

重組AAV載體

基因工程化(hua)的(de)AAV能(neng)轉導外源基因，借助特(te)定啟(qi)動子、光遺傳學(xue)/化(hua)學(xue)遺傳學(xue)元件、鈣指示(shi)劑、神經遞質(zhi)探針或Cre/lox P，Flp／FRT重組(zu)酶技術(shu)，可選擇性地標記(ji)特(te)定的(de)神經元。重組(zu)AAV基因傳遞效(xiao)果好、缺乏致病性和安全性高、宿主細(xi)胞范圍廣、在體內表(biao)達時間(jian)長，是目前最(zui)有(you)前途(tu)和最(zui)成(cheng)功(gong)的(de)基因治(zhi)療載體之一。

腺相關病毒載體（二）

現階段研究人員已發現12種(zhong)人類AAV 血(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)（AAV1至AAV12）和 100多種(zhong)非人類靈長動物AAV血(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)。不(bu)(bu)同(tong)AAV血(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)具有(you)不(bu)(bu)同(tong)的(de)衣殼蛋白空間(jian)結(jie)構、序(xu)列和組織特異(yi)性，因而其識別與結(jie)合的(de)細胞表面(mian)受體也相(xiang)應有(you)很大差別，這也導致不(bu)(bu)同(tong)血(xue)清(qing)(qing)型(xing)(xing)(xing)轉染的(de)組織類型(xing)(xing)(xing)、細胞類型(xing)(xing)(xing)和感染效率也各不(bu)(bu)相(xiang)同(tong)。

已批準用于商業用途的：AAV1和AAV2；

臨床使用頻率(lv)最(zui)高的：AAV2；AAV8，AAV9，AAVRh10；

AAV8，AAV9：靶向全(quan)身(shen)的多種肌肉類型；

幾乎所有天(tian)然AAV衣殼都可以在全身給藥后(hou)有效地轉到(dao)肝臟(zang)；

人類AAV1至AAV9識別的細胞表面受體

AAV1至AAV9的不同組織親噬性

怎樣實現器官/細胞特異的表達？

1. 局部注射，直接在想表達的地方注射 rAAV ，適合器官水平特(te)異(yi)感染，容易(yi)操作。

2. 使(shi)用組(zu)(zu)(zu)織(zhi)/器官(guan)特(te)異啟(qi)動子來表達外(wai)源基因包裝(zhuang) rAAV， rAAV 即使(shi)感染了其他組(zu)(zu)(zu)織(zhi)也由于特(te)異性啟(qi)動子而不(bu)會在(zai)其他組(zu)(zu)(zu)織(zhi)中表達。

3.Cre-on，Flex，DIO，double floxed :使用 Cre-Loxp 系統，經(jing)過兩(liang)次染色體重組在特定臟器中(zhong)表達外源(yuan)基因。

ssAAV & scAAV

目前，研究人員常(chang)用的(de)(de)兩(liang)類AAV分別(bie)為(wei)single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是(shi)基于2個基礎被開發的(de)(de)：一(yi)(yi)個是(shi)理論(lun)基礎：無論(lun)scAAV還(huan)是(shi)rAAV，病毒顆粒中均可包裹二倍體(ti)，甚至四(si)倍體(ti)的(de)(de)AAV基因組DNA；一(yi)(yi)個是(shi)結構(gou)基礎：wtAAV ITR序列(lie)的(de)(de)特殊性(T型結構(gou))。ssAAV包裝基因組正義鏈(lian)(lian)和反(fan)義鏈(lian)(lian)的(de)(de)幾率一(yi)(yi)樣(yang)。ssAAV在入(ru)核、脫衣殼(ke)后(hou)，需要(yao)借助(zhu)宿主DNA聚合酶或者分子(zi)間(jian)退火完成(cheng)雙鏈(lian)(lian)轉(zhuan)化，才能啟動基因轉(zhuan)錄過程，而scAAV中已存在雙鏈(lian)(lian)，它入(ru)核后(hou)即可啟動基因轉(zhuan)錄，跨過了雙鏈(lian)(lian)轉(zhuan)化的(de)(de)步(bu)驟，從而實現外源基因的(de)(de)快速表達。

 ssAAV和scAAV向(xiang)靶(ba)細(xi)胞中遞送外源基(ji)因的過(guo)程：

組織特異性AAV的選擇

AAV血(xue)清型種類(lei)眾(zhong)多，其衣殼蛋(dan)白氨基酸(suan)序列、結構以及它們與宿主細(xi)(xi)胞(bao)因子相互(hu)作(zuo)用(yong)的(de)差異(yi)性(xing)導致(zhi)不(bu)同(tong)血(xue)清型AAV對不(bu)同(tong)的(de)組織和細(xi)(xi)胞(bao)感染效率不(bu)同(tong)，使用(yong)AAV作(zuo)為載體(ti)工具時，應選擇組織特(te)異(yi)性(xing)強 的(de)血(xue)清型/變體(ti)，提高其轉導效率。

現階(jie)段研究人(ren)員已發現12種(zhong)人(ren)類(lei)AAV 血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)（AAV1至(zhi)(zhi)AAV12）和(he) 100多種(zhong)非人(ren)類(lei)靈長動物(wu)AAV血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)。下面(mian)列舉了人(ren)類(lei)AAV1至(zhi)(zhi)AAV9識別的(de)細胞表面(mian)受體及不同組織親嗜(shi)性，可(ke)根據(ju)組織類(lei)型(xing)選(xuan)擇(ze)(ze)合適的(de)AAV血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)。在選(xuan)擇(ze)(ze)血(xue)清(qing)(qing)(qing)型(xing)時，盡量選(xuan)擇(ze)(ze)對靶組織和(he)細胞有更高特異性和(he)轉導(dao)效率的(de)AAV。

AAV注射方式如何選擇？

在利用AAV進行研究尤(you)其是進行體內實驗時,需要將AAV通過不同(tong)的(de)方(fang)法(fa)遞(di)送(song)到體內才能發揮作用，AAV注射(she)方(fang)式會大(da)大(da)影響AAV介(jie)導的(de)轉基因的(de)效率，因此，在確定(ding)好合適(shi)的(de)AAV血(xue)清型、啟動子等條件(jian)后，配(pei)以合適(shi)的(de)AAV給藥方(fang)式會取得更(geng)好的(de)效果。

按注射(she)部(bu)位，可分(fen)為全(quan)身(shen)給藥、局部(bu)給藥和口(kou)服給藥。

01全身給藥主要(yao)分為靜(jing)脈(mo)(mo)(mo)注(zhu)射和(he)動脈(mo)(mo)(mo)注(zhu)射；靜(jing)脈(mo)(mo)(mo)注(zhu)射又分為尾(wei)靜(jing)脈(mo)(mo)(mo)注(zhu)射和(he)門靜(jing)脈(mo)(mo)(mo)注(zhu)射等；

02局(ju)部(bu)給藥主(zhu)要分為肌內注(zhu)射(she)、腫瘤內注(zhu)射(she)、腦(nao)部(bu)注(zhu)射(she)、玻(bo)璃體注(zhu)射(she)、鼻(bi)腔吸入等(deng)； 

03口服(fu)給(gei)藥(yao)，在(zai)(zai)消化道局部(bu)性疾病動(dong)物(wu)(wu)模型(xing)中(zhong)已取得(de)成功(gong)，在(zai)(zai)全身性疾病（糖尿(niao)病、貧(pin)血等(deng)）基(ji)因治療(liao)研究同樣取得(de)了顯著的(de)療(liao)效。然而(er)口服(fu)AAV基(ji)因藥(yao)物(wu)(wu)在(zai)(zai)基(ji)因治療(liao)中(zhong)仍然面(mian)臨藥(yao)物(wu)(wu)傳(chuan)輸上(shang)的(de)挑戰，如胃腸道中(zhong)的(de)DNA酶的(de)降(jiang)解作用、體內體液(ye)屏障等(deng)。

在具體實驗(yan)中可以(yi)根據不同的注射部(bu)位和實驗(yan)目的選擇合適的給藥方(fang)式(shi)，在此(ci)，簡單歸納(na)了常(chang)見注射部(bu)位的給藥方(fang)式(shi)供大家參考。

為什么你的AAV病毒感染效率不高？

重組腺(xian)相(xiang)關(guan)病毒（rAAV）是目前(qian)廣泛使(shi)用的(de)基(ji)因(yin)轉(zhuan)導(dao)及(ji)基(ji)因(yin)治療工具(ju)，它(ta)可(ke)以將DNA分子轉(zhuan)導(dao)到分裂細胞(bao)及(ji)終末分化細胞(bao)中，并維持基(ji)因(yin)的(de)相(xiang)對長效(xiao)表達(da)。但(dan)實(shi)際(ji)應用時(shi)可(ke)能(neng)會發現(xian)目的(de)基(ji)因(yin)沒有(you)表達(da)或者(zhe)沒有(you)達(da)到預想效(xiao)果(guo)，此(ci)時(shi)，我(wo)們可(ke)以從以下幾(ji)個方(fang)面來進行分析：

一、考慮病毒本身的問題：

首先(xian)，病(bing)毒(du)包裝制備是否(fou)(fou)存在問題(ti)（比如外源基因是否(fou)(fou)正確(que)，病(bing)毒(du)滴(di)度是否(fou)(fou)合(he)格等），其次，病(bing)毒(du)運輸和保(bao)存方式是否(fou)(fou)得當（雖然AAV病(bing)毒(du)比較穩定，但(dan)仍建議避免反復凍融對病(bing)毒(du)滴(di)度帶來的不利影響）。

二、考慮組織特異性的問題：

前(qian)幾期我(wo)們(men)已經介紹過(guo)，AAV血清(qing)型(xing)『組織(zhi)特異(yi)性(xing)AAV的選擇』、啟(qi)動子『AAV應用之組織(zhi)特異(yi)性(xing)啟(qi)動子的選擇』、注射(she)方式(shi)『AAV注射(she)方式(shi)如何選擇？』以(yi)及(ji)注射(she)量都是影(ying)響AAV病(bing)毒(du)感染效率的重要(yao)因素。如果AAV感染細胞或進行動物注射(she)后沒(mei)有檢測到表達(da)或者表達(da)效果不好，可以(yi)綜合(he)考慮以(yi)上因素進行優(you)化(hua)。

三、考慮檢測時間的問題：

通常情況下，AAV在(zai)體內表達(da)(da)(da)需要(yao)1-2周的(de)時(shi)間，表達(da)(da)(da)時(shi)間一般能持續半年或更久。如果(guo)檢測時(shi)間過早(zao)，可能達(da)(da)(da)不到理想的(de)效果(guo)。如果(guo)想要(yao)實現(xian)更快的(de)表達(da)(da)(da)，可以根(gen)據基因大小和具體實驗需求等選擇scAAV，scAAV較ssAAV表達(da)(da)(da)速度更快，且能實現(xian)更高水平的(de)表達(da)(da)(da)。

四、考慮檢測方式的問題：

1、目(mu)的基因的mRNA和(he)蛋白(bai)表達一般通過qRT-PCR和(he)Western Blot方法(fa)進行檢測。組織的裂解及RNA或蛋白(bai)的提取(qu)是否(fou)充分等因素應該被(bei)考慮。

2、如果載體(ti)上添(tian)加了(le)熒(ying)(ying)光標(biao)簽(qian)，進行免(mian)疫熒(ying)(ying)光染色分析時(shi)，應考慮(lv)組織細(xi)胞固定的(de)及(ji)時(shi)性(xing)或(huo)組織樣本切片(pian)制備的(de)過程中熒(ying)(ying)光蛋白的(de)穩定性(xing)等(deng)因素(su)。在選擇檢測方法時(shi)，我們通常建(jian)議采用多種檢測方式(shi)對病毒和基因表達的(de)情況進行檢測。

五、考慮其他因素：

除以上幾種因(yin)素外，實(shi)驗(yan)(yan)人員的操作手(shou)法是否(fou)嫻熟(shu)、選用的實(shi)驗(yan)(yan)細胞/動物是否(fou)滿足實(shi)驗(yan)(yan)需求等也是影響實(shi)驗(yan)(yan)成(cheng)功與否(fou)的關鍵因(yin)素。此(ci)外，建議在正式實(shi)驗(yan)(yan)前進行多次(ci)預實(shi)驗(yan)(yan)以期達到更好的實(shi)驗(yan)(yan)效果。