關于AAV載體

腺相關病毒載體（一）

腺相關病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)（Adeno-associated virus，AAV）是一種(zhong)單鏈(lian)DNA復(fu)制(zhi)缺陷(xian)型細(xi)小病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)，它的(de)(de)生命周期依(yi)賴(lai)于復(fu)制(zhi)病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)參與。AAV基因(yin)(yin)組(zu)大(da)小為(wei)4.7 kb，由(you)末(mo)端反向重復(fu)序列ITR和中間(jian)的(de)(de)rep、cap基因(yin)(yin)組(zu)成。ITRs對于病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)的(de)(de)復(fu)制(zhi)和包裝(zhuang)具有重要作用；rep基因(yin)(yin)編碼(ma)參與病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)復(fu)制(zhi)、包裝(zhuang)和基因(yin)(yin)組(zu)整合(he)的(de)(de)非結構(gou)蛋(dan)(dan)(dan)白，cap基因(yin)(yin)編碼(ma)結構(gou)蛋(dan)(dan)(dan)白VP1、VP2和VP3，3種(zhong)蛋(dan)(dan)(dan)白分別按1:1:10的(de)(de)比例組(zu)裝(zhuang)形成病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)衣殼(ke)，充當病(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)基因(yin)(yin)傳遞(di)載體(ti)。此外，cap基因(yin)(yin)內嵌(qian)套的(de)(de)另一個開(kai)放閱(yue)讀框編碼(ma)裝(zhuang)配激活(huo)蛋(dan)(dan)(dan)白AAP，參與衣殼(ke)蛋(dan)(dan)(dan)白的(de)(de)靶向和裝(zhuang)配。

AAV轉導細胞(bao)主要經(jing)歷了細胞(bao)表(biao)面受體介(jie)導的內(nei)吞、逃離內(nei)體、入(ru)核、脫衣殼和(he)雙鏈轉化幾個過程。進入(ru)細胞(bao)后(hou)，可以(yi)在(zai)輔助病(bing)毒的存(cun)在(zai)下進入(ru)其復制周期(qi)。

AAV轉導細胞過程

重(zhong)組AAV載(zai)體可以(yi)通(tong)過(guo)將內源性的(de)rep和cap基因替換為(wei)一個表達盒，該表達盒由一個啟動子(zi)驅動一個感(gan)興(xing)趣的(de)轉基因和一個poly（A）尾巴組成。通(tong)過(guo)包裝質粒反式(shi)提(ti)供rep和cap基因以(yi)及腺病(bing)毒(du)輔(fu)助(zhu)(zhu)質粒來包裝載(zai)體。病(bing)毒(du)編碼序(xu)列的(de)完全(quan)去除使AAV的(de)包裝能力最大化(hua)（包裝容量為(wei)4.5Kb），并(bing)且(qie)有助(zhu)(zhu)于它們在體內遞(di)送時(shi)的(de)低(di)免疫原性和細胞(bao)毒(du)性。

重組AAV載體

基(ji)因工程(cheng)化(hua)的AAV能轉導外源基(ji)因，借助特定啟動(dong)子、光遺傳(chuan)學/化(hua)學遺傳(chuan)學元(yuan)件、鈣指示劑、神經遞質(zhi)探針或Cre/lox P，Flp／FRT重組酶技術，可選擇性地標記特定的神經元(yuan)。重組AAV基(ji)因傳(chuan)遞效果好、缺(que)乏致病性和(he)(he)安全性高、宿主細胞范圍廣、在體內表達時間長，是目前最有前途和(he)(he)最成功的基(ji)因治療載(zai)體之一。

腺相關病毒載體（二）

現階段研究人員已發現12種(zhong)人類AAV 血清(qing)(qing)(qing)型（AAV1至AAV12）和(he) 100多(duo)種(zhong)非人類靈長動物AAV血清(qing)(qing)(qing)型。不(bu)(bu)同AAV血清(qing)(qing)(qing)型具(ju)有(you)不(bu)(bu)同的(de)衣殼蛋(dan)白空間結構(gou)、序(xu)列和(he)組織特異(yi)性，因而其(qi)識(shi)別與結合的(de)細胞表面(mian)受體也相應有(you)很(hen)大差別，這也導致不(bu)(bu)同血清(qing)(qing)(qing)型轉染的(de)組織類型、細胞類型和(he)感染效率(lv)也各不(bu)(bu)相同。

已批準用(yong)于(yu)商業(ye)用(yong)途的：AAV1和AAV2；

臨床使用(yong)頻率最(zui)高(gao)的：AAV2；AAV8，AAV9，AAVRh10；

AAV8，AAV9：靶向全身的多種(zhong)肌(ji)肉類型；

幾乎所(suo)有天然AAV衣殼都可以在全身給藥后有效地轉到肝(gan)臟；

人類AAV1至AAV9識別的細胞表面受體

AAV1至AAV9的不同組織親噬性

怎樣實現器官/細胞特異的表達？

1. 局部注射(she)，直接在想表達(da)的(de)地(di)方(fang)注射(she) rAAV ，適合器官(guan)水(shui)平(ping)特(te)異感染，容易(yi)操作。

2. 使(shi)用組織/器官特異(yi)啟動(dong)子來(lai)表(biao)達外(wai)源(yuan)基因包裝 rAAV， rAAV 即(ji)使(shi)感染了(le)其他組織也由于特異(yi)性啟動(dong)子而(er)不會在其他組織中表(biao)達。

 3.Cre-on，Flex，DIO，double floxed :使用 Cre-Loxp 系統，經過兩次染色體重組在(zai)特定(ding)臟器中(zhong)表達外(wai)源(yuan)基因(yin)。

ssAAV & scAAV

目前(qian)，研究人員常用的(de)兩類(lei)AAV分別(bie)為single-stranded AAV (ssAAV) and self-complementary AAV (scAAV)。scAAV是基(ji)于2個(ge)基(ji)礎(chu)(chu)被開(kai)發的(de)：一個(ge)是理論(lun)基(ji)礎(chu)(chu)：無(wu)論(lun)scAAV還是rAAV，病毒顆(ke)粒(li)中均可(ke)包(bao)裹二倍體，甚至四(si)倍體的(de)AAV基(ji)因組DNA；一個(ge)是結構基(ji)礎(chu)(chu)：wtAAV ITR序列(lie)的(de)特殊(shu)性(T型結構)。ssAAV包(bao)裝(zhuang)基(ji)因組正(zheng)義鏈和反義鏈的(de)幾率一樣。ssAAV在(zai)入(ru)核、脫衣殼后(hou)(hou)，需要借助宿主DNA聚合酶(mei)或(huo)者分子(zi)間退(tui)火完成雙鏈轉(zhuan)化，才能啟動基(ji)因轉(zhuan)錄過(guo)(guo)程(cheng)，而scAAV中已存在(zai)雙鏈，它入(ru)核后(hou)(hou)即(ji)可(ke)啟動基(ji)因轉(zhuan)錄，跨過(guo)(guo)了雙鏈轉(zhuan)化的(de)步(bu)驟，從而實(shi)現外源基(ji)因的(de)快速表達。

ssAAV和scAAV向靶細(xi)胞中遞(di)送外源基因的(de)過程(cheng)：

組織特異性AAV的選擇

AAV血清(qing)型種類眾多(duo)，其衣(yi)殼蛋白氨(an)基酸序列、結(jie)構以及它們與(yu)宿主(zhu)細胞(bao)(bao)因子相互作用的(de)差異(yi)性導致(zhi)不(bu)同血清(qing)型AAV對不(bu)同的(de)組織和細胞(bao)(bao)感染效率不(bu)同，使用AAV作為載體工具時，應選擇組織特異(yi)性強 的(de)血清(qing)型/變體，提高其轉導效率。

現(xian)(xian)階段(duan)研(yan)究人員已發現(xian)(xian)12種(zhong)人類(lei)AAV 血清型(xing)（AAV1至(zhi)AAV12）和 100多(duo)種(zhong)非(fei)人類(lei)靈長動物AAV血清型(xing)。下(xia)面列舉了人類(lei)AAV1至(zhi)AAV9識別的(de)細胞(bao)表面受體(ti)及不同(tong)組(zu)織(zhi)親嗜性(xing)，可根(gen)據組(zu)織(zhi)類(lei)型(xing)選擇合適的(de)AAV血清型(xing)。在選擇血清型(xing)時，盡量選擇對靶(ba)組(zu)織(zhi)和細胞(bao)有更高(gao)特異性(xing)和轉導(dao)效率的(de)AAV。

AAV注射方式如何選擇？

在(zai)利用(yong)AAV進行研(yan)究尤其是進行體內(nei)實驗(yan)時,需要將(jiang)AAV通過不同(tong)的(de)方法遞送到體內(nei)才(cai)能(neng)發(fa)揮作(zuo)用(yong)，AAV注(zhu)射方式會大大影響AAV介導的(de)轉基(ji)因的(de)效率，因此，在(zai)確定好合適的(de)AAV血清(qing)型、啟動子(zi)等條件(jian)后，配以(yi)合適的(de)AAV給藥(yao)方式會取得更好的(de)效果。

按注射(she)部位，可分為全(quan)身給藥(yao)、局部給藥(yao)和口服給藥(yao)。

01全身給藥主要分(fen)為靜(jing)脈(mo)注(zhu)射(she)和(he)動(dong)脈(mo)注(zhu)射(she)；靜(jing)脈(mo)注(zhu)射(she)又分(fen)為尾靜(jing)脈(mo)注(zhu)射(she)和(he)門靜(jing)脈(mo)注(zhu)射(she)等；

02局部給藥主要分為(wei)肌內注射(she)(she)、腫瘤內注射(she)(she)、腦部注射(she)(she)、玻璃(li)體注射(she)(she)、鼻腔吸(xi)入(ru)等； 

03口服(fu)給藥(yao)，在消化(hua)道(dao)(dao)局部(bu)性疾(ji)病動物模型中(zhong)已取得成功(gong)，在全身性疾(ji)病（糖尿(niao)病、貧血等）基(ji)因治療研究同樣取得了(le)顯(xian)著的療效(xiao)。然而口服(fu)AAV基(ji)因藥(yao)物在基(ji)因治療中(zhong)仍然面臨藥(yao)物傳(chuan)輸上的挑戰，如胃腸道(dao)(dao)中(zhong)的DNA酶的降解作用、體(ti)內體(ti)液屏障(zhang)等。

在具體實(shi)驗中可以根據不同的注(zhu)射(she)部位(wei)和實(shi)驗目的選擇合適的給(gei)藥方(fang)式，在此(ci)，簡單歸納(na)了(le)常見(jian)注(zhu)射(she)部位(wei)的給(gei)藥方(fang)式供大家參考。

為什么你的AAV病毒感染效率不高？

重組腺相關(guan)病毒(du)（rAAV）是目(mu)前廣泛(fan)使用的(de)基因轉導及(ji)基因治療工具，它可以將(jiang)DNA分子轉導到(dao)分裂細胞及(ji)終末分化細胞中，并維(wei)持基因的(de)相對長(chang)效表達(da)。但實際應用時(shi)可能會發(fa)現目(mu)的(de)基因沒有(you)表達(da)或(huo)者沒有(you)達(da)到(dao)預想效果，此(ci)時(shi)，我們可以從以下幾(ji)個(ge)方(fang)面來進行分析：

一、考慮病毒本身的問題：

首先，病毒(du)包裝制(zhi)備是(shi)(shi)否(fou)存在問(wen)題(ti)（比如外(wai)源基(ji)因是(shi)(shi)否(fou)正確(que)，病毒(du)滴度(du)是(shi)(shi)否(fou)合(he)格等），其次，病毒(du)運輸(shu)和(he)保存方(fang)式是(shi)(shi)否(fou)得當（雖然AAV病毒(du)比較穩定，但仍建議(yi)避免(mian)反復凍融對病毒(du)滴度(du)帶來的不利影(ying)響）。

二、考慮組織特異性的問題：

前幾期我們已(yi)經(jing)介紹過，AAV血清型(xing)『組(zu)織特異(yi)性(xing)AAV的選(xuan)(xuan)擇』、啟動子『AAV應用之組(zu)織特異(yi)性(xing)啟動子的選(xuan)(xuan)擇』、注(zhu)射方(fang)式『AAV注(zhu)射方(fang)式如何選(xuan)(xuan)擇？』以(yi)(yi)及注(zhu)射量都是影響AAV病毒感染(ran)效(xiao)率的重要(yao)因(yin)素。如果AAV感染(ran)細(xi)胞(bao)或進(jin)行(xing)動物(wu)注(zhu)射后沒有檢(jian)測到表(biao)達或者(zhe)表(biao)達效(xiao)果不好，可以(yi)(yi)綜合考慮(lv)以(yi)(yi)上因(yin)素進(jin)行(xing)優化。

三、考慮檢測時間的問題：

通常情況下，AAV在體內表(biao)達(da)需(xu)(xu)要1-2周的時(shi)間，表(biao)達(da)時(shi)間一般能(neng)持續半年(nian)或更(geng)久。如(ru)果(guo)(guo)檢測時(shi)間過早，可(ke)能(neng)達(da)不到理想(xiang)的效果(guo)(guo)。如(ru)果(guo)(guo)想(xiang)要實現更(geng)快的表(biao)達(da)，可(ke)以(yi)根據基因大小和具體實驗需(xu)(xu)求等選擇(ze)scAAV，scAAV較ssAAV表(biao)達(da)速度更(geng)快，且能(neng)實現更(geng)高水平(ping)的表(biao)達(da)。

四、考慮檢測方式的問題：

1、目的(de)基因(yin)(yin)的(de)mRNA和蛋白表達(da)一般通過qRT-PCR和Western Blot方法進行檢測。組織的(de)裂解(jie)及RNA或蛋白的(de)提取是否充(chong)分等因(yin)(yin)素應該被考慮。

2、如果載體(ti)上添加(jia)了熒(ying)光(guang)(guang)標(biao)簽(qian)，進行免(mian)疫熒(ying)光(guang)(guang)染色分(fen)析時，應考(kao)慮組(zu)織(zhi)細胞(bao)固定的(de)及時性(xing)或組(zu)織(zhi)樣本切片(pian)制備的(de)過程中熒(ying)光(guang)(guang)蛋白的(de)穩定性(xing)等因素。在選擇檢(jian)測(ce)方(fang)法時，我們(men)通常建議采(cai)用多種檢(jian)測(ce)方(fang)式對病毒和基因表(biao)達的(de)情況(kuang)進行檢(jian)測(ce)。

五、考慮其他因素：

除以(yi)上幾種因素(su)外，實驗(yan)人員的操作手法是否嫻熟、選(xuan)用的實驗(yan)細(xi)胞/動物是否滿足實驗(yan)需求等也是影響實驗(yan)成功與(yu)否的關(guan)鍵因素(su)。此外，建議在正式實驗(yan)前進行多次預實驗(yan)以(yi)期達到(dao)更好(hao)的實驗(yan)效果。