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鼻內滴注法是一種直接的(de)(de)AAV感染法，操作簡(jian)單且對設備(bei)要(yao)求(qiu)低，對新手實(shi)驗員也同樣適用。缺點是AAV顆粒容易(yi)沉積(ji)在上呼吸道（鼻(bi)道、鼻(bi)竇和咽）和胃腸道，如果需要(yao)有效地感染到下(xia)呼吸道，則可能需要(yao)更大(da)劑量的(de)(de)AAV才能實(shi)現(xian)。
（1）腹腔注射(she)氯胺酮(tong)和甲苯噻嗪將小鼠(shu)麻醉；
注意(yi)：為了保持小鼠穩定的呼吸頻率，不應(ying)過度麻(ma)醉(zui)。
（2）甲按(an)圖1所示兩種方法將小鼠控制好(hao)，防止其用嘴呼吸；
（3）乙緩慢滴(di)一滴(di)AAV懸液(ye)于小鼠鼻孔內壁，待(dai)液(ye)體被吸入(ru)后(hou)再滴(di)下一滴(di)，重復此(ci)操作至40μL AAV懸液(ye)全部滴(di)完(wan)；
（4）使小(xiao)鼠保持上述(shu)姿勢約30~60s，以便AAV懸液充分進(jin)入下呼吸道(dao)；
（5）待(dai)小鼠(shu)在籠中恢復(fu)10min后，重復(fu)上述操(cao)作，再(zai)次給藥(yao)40μL（每(mei)只小鼠(shu)共給藥(yao)80μL）；
（6）將小鼠放(fang)回籠中直至完全清醒(xing)。
口腔氣管插管術能夠將病毒載體直接灌輸入肺中，卻沒有外科手術的風險，并且避免了上呼吸道的病毒顆粒的損失。由于幾乎所有AAV病毒顆粒都會到達肺內，所以要嚴格控制AAV的使用量。同時，與鼻內滴注(zhu)法相比，口腔氣管插管術需要一些特殊設備，操(cao)作起來(lai)也(ye)稍(shao)有難度。
（1）腹腔注(zhu)射氯胺酮和甲苯噻嗪將小鼠麻醉；
注意：動物必須處于足夠深的麻醉狀態以防止運動或對載體的反應而打噴嚏或咳嗽；
（2）將小(xiao)鼠(shu)放(fang)在垂直支架上(shang)，將門牙(ya)環(huan)置于小(xiao)鼠(shu)上(shang)門牙(ya)上(shang)，讓老鼠(shu)的腹(fu)部(bu)面向自己；
（3）輕(qing)輕(qing)地(di)把小(xiao)鼠舌頭(tou)拉出來，并(bing)用拇指和食指按住，中(zhong)指放在小(xiao)鼠頸(jing)部和塑料支架之間；
（4）用食指(zhi)、拇指(zhi)在(zai)小鼠舌(she)上牽引令其嘴張開，使插管(guan)路徑伸直(zhi)，并(bing)用中指(zhi)在(zai)頸后調(diao)整頭部角度；
（5）利用光纖作為光源和引導者，推動它通過可視聲(sheng)帶（如果(guo)看不到聲(sheng)帶，用中指作支撐(cheng)，輕(qing)輕(qing)用力拉舌）；
（6）光纖插入后，同(tong)時將導(dao)管向前推進(jin)約5mm，然后勿(wu)移動(dong)導(dao)管，取出光纖；
（7）使小鼠平躺，用膠帶(dai)將導管固定(ding)在小鼠嘴部(bu)防止(zhi)其(qi)移動，另(ling)一端用橡(xiang)皮泥支撐(cheng)；
（8）用(yong)注(zhu)射(she)器通(tong)過(guo)導管輸入80μL AAV； 注(zhu)意：在抽取80μL載體(ti)之前，吸取約100μL的(de)空氣至移液管尖，以防止載體(ti)的(de)丟失(shi)，并促(cu)進載體(ti)深入肺部；
（9）等待(dai)5min，使(shi)AAV充分進(jin)入(ru)下呼(hu)吸道；
（10）把導管移出(chu)，將小鼠輕輕從工作臺拿下(xia)，并將頭部和(he)胸部用折疊的(de)紙巾小幅度墊高，以保證小鼠順暢的(de)呼吸；
（11）將(jiang)小鼠(shu)放回籠中直(zhi)至完全清醒。
與鼻內滴注相比，氣管內注射能夠提高AAV進入(ru)肺部(bu)的(de)效(xiao)率；與(yu)口腔氣(qi)管(guan)插管(guan)法(fa)相(xiang)比，設備更簡單，操(cao)作更容易。然而(er)，氣(qi)管(guan)內注射(she)具有(you)極高的(de)外科手(shou)術風險，包(bao)括出血(xue)、切口開裂(lie)、感染以及較長的(de)恢復(fu)期等。不僅(jin)如此，由(you)于(yu)小(xiao)鼠氣(qi)管(guan)窄小(xiao)，很容易出現操(cao)作失(shi)誤，將AAV注射(she)到氣(qi)管(guan)周圍組織或食管(guan)中去。
（1）腹(fu)腔注射氯胺酮和甲苯(ben)噻嗪將小鼠麻(ma)醉(zui)；
（2）將(jiang)小(xiao)鼠以背(bei)臥(wo)姿勢固(gu)定(ding)在嚙齒動物工作臺上，并(bing)將(jiang)其前爪伸直固(gu)定(ding)；
（3）剃除頸(jing)部部分(fen)區域的鼠毛，并用碘伏(fu)做消毒處理；
（4）用手術剪刀在頸部(bu)做一個5~7mm的小切口；
（5）手握鑷子固(gu)定住小(xiao)鼠氣(qi)(qi)管，另一只手握住注射(she)器(qi)，使注射(she)器(qi)針頭斜面朝上，與氣(qi)(qi)管成45°。
注意：一旦針頭插入，輕輕地將針頭向外移動，遠離小鼠身體，確定針頭是否正確地插入氣管。
（6）將40~80μL 的AAV緩慢(man)注入氣管，等(deng)待5s后慢(man)慢(man)取出針管；
（7）縫合傷口，將(jiang)小鼠放回籠中(zhong)恢(hui)復，直到(dao)完全清醒。
經輸尿管腎盂逆行注射后，基因(yin)表(biao)達分布在腎臟管道系統，可以克服腎小球屏障限制，但注射較難，技術挑戰性較大，可根(gen)據具體實(shi)(shi)驗(yan)目的(de)(de)和實(shi)(shi)際(ji)情況選(xuan)擇合適的(de)(de)注射方式。下(xia)面來分享一(yi)下(xia)經輸尿管腎盂逆行注射的(de)(de)操作手法：
① 對(dui)C57BL/6 小鼠（4-6 周齡，15-20g）進行麻醉手(shou)術，并使小鼠呈仰(yang)臥姿勢于操作臺(tai)上；
② 在(zai)小鼠左腹(fu)部做一個(ge)切口并輕輕剖開，找到輸尿管遠端(duan)和腎動(dong)脈并用顯(xian)微止血夾夾住；
③ 用 30G注射針(zhen)刺破輸尿管，將注射針(zhen)貼合(he)于管壁并固定到(dao)位，使用 6-0縫線縫合(he)以防液體泄(xie)漏；
④ 將尿液輕輕吸出，將注(zhu)(zhu)射器替(ti)換為另(ling)一個(ge)(ge)含(han)有約 50ul液體(ti)（含(han)有 5*10E10個(ge)(ge)病毒顆粒基(ji)因組(zu)拷貝數或PBS）的注(zhu)(zhu)射器，并緩慢地(di)將液體(ti)逆行注(zhu)(zhu)入輸(shu)尿管；
⑤ 將注(zhu)射(she)針撤出，并(bing)在注(zhu)射(she)部位的近端(duan)放置(zhi)一個顯(xian)微止(zhi)血夾(jia)以防液(ye)體(ti)泄漏；
⑥ 5min后，移(yi)去輸(shu)尿管遠端(duan)、近端(duan)及腎動脈上的顯微止血夾，用(yong)6-0縫線將(jiang)切口(kou)分(fen)兩層縫合。
經腎實質腎盂注射后，基因表(biao)達(da)分布在皮(pi)質(zhi)(zhi)和(he)髓質(zhi)(zhi)的(de)腎(shen)(shen)小管上皮(pi)細胞(bao)中，主要是(shi)集合(he)管細胞(bao)。此方法是(shi)一(yi)種新的(de)注(zhu)射方式，操作簡單，基因表(biao)達(da)穩定。下面分享一(yi)下經腎(shen)(shen)實質(zhi)(zhi)腎(shen)(shen)盂注(zhu)射的(de)操作方式供(gong)參考：
① 對C57BL/6 小(xiao)鼠（4-6 周齡，15-20g）進行麻醉手(shou)術(shu)，并使(shi)小(xiao)鼠呈仰(yang)臥姿勢于操作(zuo)臺上；
② 對小鼠左腹進(jin)行(xing)剃毛處理(li)，切開(kai)一個2cm的(de)切口(kou)暴露左腎和輸尿(niao)管，并將周圍器官和脂肪輕(qing)輕(qing)分(fen)開(kai)；
③ 用顯微止(zhi)血(xue)夾(jia)夾(jia)住輸尿管上段(duan)以阻止(zhi)病毒(du)原液下(xia)流至(zhi)膀(bang)胱(guang)；
④ 用(yong)30G注(zhu)射針(zhen)刺入(ru)左腎中極的(de)腎盂(yu)（注(zhu)意注(zhu)射針(zhen)頭不應刺穿腎盂(yu)），將(jiang)50μL液體（含5*10E10個病(bing)毒顆粒基(ji)因組拷(kao)貝數或PBS）注(zhu)入(ru)腎盂(yu)；
注：注射針刺入腎盂而不刺穿腎盂的關鍵在于注意比對穿刺針和小鼠腎臟，并且在注射針上做好標記；
⑤ 5min后移去顯微止血夾，將切口分(fen)兩層縫合。
哺乳動物的腎臟具有嚴格的過濾功能，排斥大于50kDa的蛋白質，此外，腎小球內的足細胞形成直徑僅為10nm的狹縫橫膈膜，傳統的AAV載體全身給藥難以在腎臟達到足夠的表達水平，即便是高劑量給藥也會導致AAV集中在肝臟等腎外器官中。為了提高病毒載體對腎臟的轉導并降低病毒載體對腎外器官的轉導效率，除了全身給藥方式外，近年來，科學家陸續開發了腎臟局部給藥途徑包括腎動脈注射、腎靜脈注射、經腎實質注射、經輸尿管逆行給藥和經腎實質腎盂注射等(圖1)。
攜帶(dai)目的(de)基因的(de)病毒載體通過腎靜脈注射后(hou)，基因可在皮質和(he)髓質中表達，主要在腎小(xiao)球和(he)近端小(xiao)管中表達，但難以突破腎小(xiao)球屏障，效(xiao)率較(jiao)低(di)。下面就(jiu)來(lai)分享一下腎靜脈注射的(de)操作方式：
① 對C57BL/6 小鼠(shu)（4-6 周齡，15-20g）進行麻(ma)醉手術，并使小鼠(shu)呈(cheng)仰臥姿勢于操作臺上(shang)；
② 給(gei)小鼠左腹(fu)剃毛，在小鼠左腹(fu)部做一個切口(kou)，暴(bao)露(lu)左腎及腎蒂，并將腎靜脈從腎蒂中游離；
③ 用顯微(wei)止血夾夾住腎靜脈(mo)遠端以阻止病(bing)毒(du)原液流出腎臟；
④ 用30G注射針刺入左腎(shen)靜(jing)脈近端，將(jiang)50μl液體（含(han)有(you) 5*10E10個病毒顆粒基因組拷貝(bei)數或 PBS）注入腎(shen)靜(jing)脈；
⑤ 5min后，拔出注(zhu)射針，移去顯(xian)微止血夾并(bing)壓迫止血片刻，將切口分(fen)兩層(ceng)縫合。
AAV在肝臟中的注射方式分為直接傳送和外周傳送兩種（下表所示），直接傳送靶向性(xing)高(gao)但(dan)侵入性(xing)強且對實驗技(ji)能要求高(gao)，外周傳送操作簡(jian)單但(dan)靶向性(xing)稍(shao)差，操作者可根據(ju)實驗目的選擇合適(shi)的注射方式。
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注射 |
覆蓋 | 優點 | 缺點 |
|---|---|---|---|
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直接 傳送 |
肝葉注射、門靜脈注射、脾包膜注射；肝動脈注射（大動物與人）； | 克服了轉導效率低的問題，靶向性高，所需病毒量少； | 侵入性強，風險大，實驗操作技能要求高； |
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外周 傳送 |
腹腔注射和靜脈注射（尾靜脈注射和眶后靜脈竇注射等）； | 操作簡單，無須手術或麻醉； | 靶向性較直接傳送稍差，可能需要較多的注射體積； |
01 通過腹(fu)腔注射麻(ma)醉(zui)劑將成年小鼠麻(ma)醉(zui)，對(dui)小鼠腹(fu)部局部區域做去毛及消毒處理；
02 在距劍突軟骨下方2-3mm處，做(zuo)一個2-3cm的中(zhong)線切口。
03 暴露門靜脈，使用30G針頭在1min內均勻緩慢注射0.2 ml病毒懸液。
注：門靜脈(mo)(mo)是一種相對(dui)較大的靜脈(mo)(mo)，提(ti)起肝前葉一般即可看到門靜脈(mo)(mo)。在手術過程中，用(yong)浸泡在生(sheng)理鹽(yan)水中的無菌紗布覆(fu)蓋腸道，保持腸道濕潤。
04 注射后保持針位約10-20秒。取出針后(hou)，做好防(fang)出血(xue)處理；
05 縫合腹部，將(jiang)小鼠放(fang)置(zhi)于加熱(re)燈下，直(zhi)(zhi)至恢復意識(shi)。然(ran)后將(jiang)其放(fang)回籠(long)子(zi)單獨飼(si)養，直(zhi)(zhi)到(dao)傷口(kou)完(wan)全(quan)愈合。
肝內(nei)注射(she)可以克服轉(zhuan)導效率低的問題，靶(ba)向性高，所(suo)需病(bing)毒(du)量(liang)少；缺點則是侵入性強，風險大，實驗(yan)操(cao)作技(ji)能要求高，研究者可根據(ju)實驗(yan)目的選擇(ze)合適(shi)的操(cao)作方(fang)式。下圖(tu)為(wei)小(xiao)鼠肝臟AAV給藥途(tu)徑(jing)示意(yi)圖(tu)：
01 通過腹(fu)(fu)腔注射麻(ma)醉劑將成(cheng)年小鼠麻(ma)醉，對小鼠腹(fu)(fu)部(bu)局部(bu)區域做去毛及消(xiao)毒處(chu)理(li)；
02 在(zai)距劍突軟骨下方2-3mm，做一(yi)個2-3cm的中線切口，以露(lu)出肝(gan)臟(zang)。
03 用固定在結核(he)菌素注射器上的(de)30G針(zhen)頭將病毒懸液緩慢注入(ru)肝實質(zhi)中。
注：在注射過程中通過手術立體鏡監測注射部位，確保無出血或外滲。如果出現上述任何一種情況，需取出針頭，輕輕按壓止血，然后選擇一個新的部位進行注射。
04 取出針(zhen)，用無菌紗布輕(qing)輕(qing)按(an)壓止血。
05 再選擇(ze)其他部(bu)位進行注射。
06 縫合腹部(bu)，將小鼠放置于(yu)加熱燈下(xia)，直(zhi)至恢復意識(shi)。然(ran)后(hou)將其放回(hui)籠子單獨(du)飼養，直(zhi)到傷口完全愈合。
注：一只成年小鼠一次可選擇4 ~ 5個不同的注射位點(40 ~ 50μl/site)，總劑量可達200μl。
肝臟對(dui)全身應用(yong)AAV有較(jiao)高的親和性，使(shi)用(yong)外周(zhou)傳遞方式(shi)如靜脈注射(she)，配(pei)合AAV8等(deng)肝臟嗜(shi)性較(jiao)強的血清型以(yi)及(ji)TBG等(deng)肝臟特異性啟(qi)動子也(ye)可以(yi)較(jiao)好(hao)的將目的基(ji)因遞送到肝臟進(jin)行表(biao)達，操作(zuo)方式(shi)簡單(dan)且(qie)對(dui)動物侵入性傷(shang)害(hai)較(jiao)小。
1. 尾靜脈注射
將小鼠放在標(biao)準限(xian)制器中，使注射(she)器能(neng)夠完全接觸(chu)到(dao)整個(ge)尾巴長度。
將一根(gen)30G的針(zhen)頭固定在(zai)1cc結核菌素注射器上，盡(jin)可(ke)能遠的插(cha)入(ru)尾(wei)部側面靜脈。選擇一個(ge)遠端部位，如果第一次注射失敗，可(ke)以(yi)選擇另一個(ge)更近端的注射部位。
注(zhu)：a：小鼠尾巴(ba)上較容易接觸到(dao)的(de)(de)靜脈位于尾巴(ba)的(de)(de)側面(mian)(mian)，且側靜脈非常(chang)淺(qian)，無需(xu)進針很深；小鼠尾部背面(mian)(mian)的(de)(de)靜脈很難(nan)常(chang)規注(zhu)射；尾部腹面(mian)(mian)的(de)(de)血管是動脈，不可注(zhu)射。b：注(zhu)射前用溫水輕輕地(di)加熱尾巴(ba)，可以使(shi)血管得到(dao)一定(ding)程度的(de)(de)舒張，便于注(zhu)射。
注射(she)完成后取下(xia)針(zhen)頭，輕(qing)輕(qing)按壓止血(xue)，然后立即將(jiang)小鼠放(fang)回籠中。
注：使用(yong)此方法(fa)注射成年小鼠，病毒用(yong)量控制在300 -400μl較(jiao)佳。
2. 新生小鼠靜脈注射
需兩個人配合(he)完成，一(yi)人固(gu)定，一(yi)人注射(she)；
注射前將小(xiao)鼠置于(yu)干毛巾上，減少活動及損傷；
一人輕輕固(gu)定(ding)小鼠，使側(ce)面(mian)朝上，暴露眼睛至頸部的顳淺靜脈，置于放大鏡下；
另一人沿著自頭至(zhi)頸的(de)(de)(de)方向將30G的(de)(de)(de)注射(she)針頭插(cha)入靜(jing)脈(mo)旁的(de)(de)(de)皮下，慢(man)慢(man)推進靜(jing)脈(mo)（新生鼠皮膚呈現半透明，較(jiao)易觀察）；
慢慢注射(she)病毒懸液；（如果注射(she)成功，注射(she)部(bu)位遠端靜脈會呈白色，如果未成功，皮下(xia)注射(she)10μl即可看到明顯的隆起）
注射完成后，取下針頭，輕輕按壓(ya)靜(jing)脈，通常2-3分鐘會停止出血；
將新生鼠在加(jia)熱燈下照(zhao)射后(hou)，放回母鼠身邊(bian)；
如(ru)果(guo)注射不成功，讓小鼠恢(hui)復5-10分鐘，然后在另(ling)一側嘗(chang)試(shi)第二次注射；
注：使用此方法注射新生小(xiao)鼠，病毒用量(liang)控制在100μl以內較(jiao)佳(jia)。
視網膜下注射（SR）是將(jiang)藥(yao)物(wu)注入光感(gan)受器細胞和(he)RPE之(zhi)間的(de)視(shi)(shi)網(wang)膜下腔(qiang)，這需要(yao)使視(shi)(shi)網(wang)膜的(de)神經上皮層與(yu)色素(su)上皮層分離，形(xing)成視(shi)(shi)網(wang)膜下腔(qiang)。SR是將(jiang)基因直接(jie)遞送至RPE細胞或(huo)光感(gan)受器細胞的(de)有效方法，但此方法侵入性較大，容(rong)易使視(shi)(shi)網(wang)膜脫離，可能(neng)會(hui)引起膠質細胞增生、光感(gan)受器退(tui)化及視(shi)(shi)力功(gong)能(neng)損(sun)傷等，并且藥(yao)物(wu)擴散有限(xian)只能(neng)實現局部轉導。
視網膜下腔注射，主要轉染視網膜色素上皮細胞和光感受器細胞，不會觸發(fa)體液免疫反應，對(dui)另一只眼再次(ci)視網膜下注射也無影響。
1、麻醉：對于(yu)成(cheng)年小(xiao)鼠(shu)(shu)，異氟醚吸入(ru)麻醉或(huo)(huo)聯合(he)使(shi)用氯胺(an)酮（100mg/ml）和(he)賽拉嗪(qin)(20mg/ml)按(an)照0.1ml/10g腹腔注射; 對于(yu)圍產期小(xiao)鼠(shu)(shu)，異氟烷吸入(ru)麻醉或(huo)(huo)低溫麻醉；
2、使用(yong)Vannas直剪沿著閉合的眼瞼裂開大(da)約1.5 mm的切口；注意切口不要太大(da)；
3、用(yong)彎曲的敷料鉗將(jiang)眼(yan)(yan)皮分開，以(yi)支撐眼(yan)(yan)睛，并在眼(yan)(yan)睛下(xia)方(fang)稍微捏緊眼(yan)(yan)皮，將(jiang)其(qi)拿起以(yi)供注射；
4、在眼球(qiu)中緯(wei)線(xian)或中緯(wei)線(xian)后方做一個小的鞏膜切(qie)(qie)口，切(qie)(qie)口夠注射針(zhen)尖(jian)端通過即可(ke)；
5、小心(xin)地將注射針插入(ru)切口(kou)部位，并(bing)平行(xing)于眼外壁進(jin)入(ru)視(shi)網膜(mo)下腔；
6、開始注射(she)，如果(guo)正確注射(she)至視網膜(mo)下腔，能感受到適(shi)度的阻力；緩慢出針，可將針頭固定15s，避免注射(she)病(bing)毒回(hui)流到切口位(wei)置；
7、使用彎曲的敷料(liao)鉗輕輕地將(jiang)眼睛推回眼眶；將(jiang)適(shi)量0.25%布比卡因，滴在注射部位(wei)；
8、小(xiao)鼠蘇(su)醒后(hou)置于加(jia)熱墊上，整個注射過程控(kong)制在5min內完成；
9、小鼠(shu)恢復(fu)活動(dong)能力(li)后放回鼠(shu)籠。
玻璃體腔注射（IVT）是(shi)將藥(yao)物直接注入眼球(qiu)玻璃體腔內(nei)(nei)(nei)，侵(qin)襲性較小、術后并發(fa)癥(zheng)較少，但由(you)于內(nei)(nei)(nei)界(jie)膜ILM的存在(zai)，大多數AAV血清型無法(fa)傳遞至(zhi)RGCs之(zhi)外的細胞內(nei)(nei)(nei)。
玻璃體腔注射較適用于視網膜神經節或Müller神經膠質細胞的靶向。此種注(zhu)射方(fang)法(fa)會產生(sheng)針對AAV衣殼(ke)蛋白的體液免(mian)(mian)疫反(fan)(fan)應，這種反(fan)(fan)應可阻礙再次(ci)注(zhu)射時(shi)AAV的表達，如果兩只眼(yan)都需(xu)要(yao)連續治療的話，需(xu)要(yao)避免(mian)(mian)使用這種注(zhu)射方(fang)式。
1、麻醉：4.3%水合氯醛 0.01ml/g ；
2、散(san)瞳：建議雙眼散(san)瞳，以防一眼出現意外時可以迅速換眼；
3、甲基纖維(wei)素(su)保持眼表濕潤；
4、抗生素眼藥水、表麻藥術前(qian)滴眼；
5、調整小(xiao)鼠頭位，讓(rang)小(xiao)鼠眼(yan)球保持角膜緣(yuan)水平(ping)位；
6、注射(she)位(wei)置：理論上(shang)是角膜(mo)緣后1mm，也有選擇在顳(nie)側進行，注意避開血(xue)管。白鼠還可以(yi)看見(jian)視網膜(mo)血(xue)管，需(xu)避開；
7、注射切口：推薦使用ALCON的10-0針(zhen)(zhen)做(zuo)切口，非(fei)常整齊(qi)，33G的針(zhen)(zhen)進去水密(mi)非(fei)常好。也可以用破囊針(zhen)(zhen)。切口越(yue)整齊(qi)，跟針(zhen)(zhen)越(yue)匹配(pei)，越(yue)不(bu)易滲漏(lou)；
8、注射進針：針尖垂直進入，隨(sui)后傾(qing)斜(xie)。這一步非常關鍵，小鼠(shu)眼球小，晶(jing)體球形，傾(qing)斜(xie)角度小了會(hui)損傷(shang)晶(jing)體，大(da)了會(hui)扎上視網膜，出血(xue)；
9、注(zhu)射：緩慢推(tui)注(zhu)，無阻(zu)力。迅(xun)速(su)推(tui)注(zhu)的話取(qu)材時會發現(xian)視網膜散在出血(xue)點，可(ke)能(neng)干擾(rao)試驗結(jie)果(guo)。推(tui)針以后留(liu)針0.5-1min，迅(xun)速(su)出針。
腦定位注射，相比其他注射方式靶向性強，注射病毒體積小，但是侵入性也強，且對操作者具有很高的要求。在立體(ti)(ti)定(ding)位手術(shu)時(shi)，顱骨(gu)上常(chang)用的注(zhu)(zhu)射參照點是(shi)前囪，也就是(shi)中矢狀(zhuang)冠(guan)狀(zhuang)縫(feng)的交叉點。具體(ti)(ti)的注(zhu)(zhu)射部(bu)位，可(ke)依據研究的需(xu)要(yao)而確定(ding)。
1、安裝定位儀：在生物安全柜中安裝(zhuang)立體定位框架和工(gong)具。
2、準備并吸取病毒懸液：在噴嘴出安裝超微(wei)量(liang)注射器，把(ba)針尖(jian)浸在準備(bei)好的AAV病毒懸液中，并使用“快速反向”功能吸取。
3、排除空氣：使用“快(kuai)速正向”功能檢(jian)查泡(pao)沫(mo)，直到在針頭處出現一(yi)滴液體。用浸泡(pao)在0.1M NaOH溶液中的棉花(hua)輕(qing)輕(qing)拭去針尖的液滴。
4、麻醉大鼠：選取(qu)250g左右的大鼠，通過25G 1毫升注(zhu)射器注(zhu)射甲苯噻嗪（10mg/kg）和氯胺酮(tong)（100mg/kg）。
5、固定大鼠：首先(xian)將大(da)鼠的(de)下(xia)切牙(ya)固(gu)(gu)定在(zai)齒棒上，然后用耳棒通過大(da)鼠的(de)外耳道進行固(gu)(gu)定，并(bing)固(gu)(gu)定頭部。檢查顱(lu)骨是否是水平(ping)的(de)，并(bing)確(que)保兩(liang)個(ge)眼睛在(zai)同一水平(ping)線(xian)上。在(zai)每(mei)只(zhi)眼睛中滴(di)入一滴(di)聚丙烯(xi)酸(suan)，以防麻醉造成眼睛干燥(zao)。調整光源對(dui)準大(da)鼠的(de)頭部，剃去頭部的(de)毛并(bing)用酒精消毒清潔。
6、切口并暴露前囪點：用(yong)刀片在頭(tou)皮(pi)上前后軸切口，并用(yong)鉗子保持(chi)刀口開放狀(zhuang)態，用(yong)棉(mian)球吸去(qu)血。去(qu)除骨膜以便看到前囪。
7、暴露λ點：調整齒夾(jia)的(de)垂直位(wei)置(zhi)，使得前囪(cong)點和λ點的(de)高度一(yi)致，如果λ點的(de)位(wei)置(zhi)難以看到，讓切(qie)口處干燥5-10min后再尋找。
8、確定前囪點的AP和ML坐標和目標注射點的距離：將(jiang)針垂直于(yu)前(qian)囪點，并記(ji)錄AP和ML坐(zuo)標的數(shu)值。參(can)考大鼠腦(nao)圖譜(pu)的標記(ji)的目標注射(she)部位(wei)的AP和ML值，計(ji)算(suan)前(qian)囪點與目標注射(she)部位(wei)的AP和ML坐(zuo)標，并做標記(ji)。
9、確定前囪點的DV坐標和目標注射點的距離：用鉆(zhan)頭(tou)在顱骨上打洞，注(zhu)意不要損傷(shang)硬腦膜。把(ba)針尖置(zhi)于(yu)硬腦膜的(de)表面并(bing)測量出前(qian)囪點DV的(de)坐標(biao)。計算目標(biao)注(zhu)射(she)部位的(de)DV坐標(biao)。
10、注射AAV：緩慢(man)垂直移動注射(she)器(qi)針尖到達目標注射(she)部(bu)位，慢(man)慢(man)地將針插入并靜置5min。然后，以0.2 μl/min的速度，將2μL的病毒(du)懸液注射(she)入腦。結束后，需要靜置5min再將注射(she)器(qi)緩慢(man)移出。
11、縫合并做標記：縫合頭皮，并(bing)做耳(er)標。
12、大鼠術后的護理：將大鼠(shu)單獨(du)(du)放在一個干凈(jing)的籠子里，直到(dao)醒(xing)來。第一天需(xu)要讓大鼠(shu)在獨(du)(du)立的通風(feng)籠中度過。
13、處理針頭和手術材料：先用0.1 M NaOH 或10%氯漂白(bai)劑清洗手(shou)術工具，并(bing)用蒸餾水沖洗，最后用酒精(jing)沖洗。
與系統注射和實質內注射相比，鞘內給藥是一種具有較低劑量要求的微創替代方法。
1、使用毛巾覆蓋在小鼠頭部和背部，露出髂嵴以下的腰部區域；用非慣用手的拇指和食指抓住鼠的髂骨(髖骨)，手的頂部輕輕放在小鼠身體和頭部上，使其保持平靜。
注：在髂骨上的握(wo)力應該足夠強，以(yi)固(gu)定小鼠(shu)的腿(tui)部(bu)活動，并(bing)使腿(tui)部(bu)向(xiang)外和(he)向(xiang)下伸展。
2、使用(yong)慣用(yong)手(shou)(shou)食指從(cong)腰(yao)椎到骶(di)部沿(yan)脊(ji)柱輕(qing)輕(qing)按(an)壓，同時使用(yong)非慣用(yong)手(shou)(shou)輕(qing)輕(qing)上拉(la)小鼠，以打開椎節之間的空間，方便進針。
3、將1 ?”號針的斜面指向小鼠頭部，然后將針以70°角插入脊柱中線的腰椎處，當感覺針碰到骨頭時，將針的角度調整到30°夾角，并將針插入椎節之間。
注：需多次嘗試找到合適的進(jin)入(ru)點，針(zhen)(zhen)頭進(jin)入(ru)脊柱后(hou)推針(zhen)(zhen)沒有(you)阻(zu)力，尾巴(ba)或后(hou)腿的反(fan)射性彈跳出(chu)現時，說明已正確入(ru)針(zhen)(zhen)。
4、輕輕壓下注射器的活塞，將5-10μL的AAV病毒懸液注射至蛛網膜下腔。
注：注射時間控制在(zai)10-30s較好(hao)，速度太快會(hui)導致小(xiao)鼠后腿抽筋(jin)，該現象會(hui)在(zai)60s內(nei)消失。
5、注射后(hou)，將針180°旋轉(zhuan)1-2次(ci)，然后(hou)將針從脊柱(zhu)中取出。
6、小鼠放回籠子觀察，確認恢復正常運動功能。
注：此法適用于成年小鼠或(huo)大鼠。
腸(chang)(chang)組織常見的注(zhu)(zhu)射(she)(she)方(fang)式有尾靜(jing)脈注(zhu)(zhu)射(she)(she)、腹腔注(zhu)(zhu)射(she)(she)、口(kou)服、灌腸(chang)(chang)和(he)(he)腸(chang)(chang)系(xi)(xi)膜上動脈（SMA）注(zhu)(zhu)射(she)(she)等。其中尾靜(jing)脈注(zhu)(zhu)射(she)(she)和(he)(he)腹腔注(zhu)(zhu)射(she)(she)作為系(xi)(xi)統性給(gei)藥(yao)方(fang)式，雖然操作簡(jian)單，損傷性小，但是注(zhu)(zhu)射(she)(she)量較大，特(te)異性不(bu)強。口(kou)服和(he)(he)灌腸(chang)(chang)，都屬于(yu)腔內給(gei)藥(yao)，主要是黏膜的轉(zhuan)導(dao)，由于(yu)胃酸(suan)及(ji)腸(chang)(chang)蛋白(bai)水解(jie)酶等的中和(he)(he)作用，其轉(zhuan)導(dao)效率并不(bu)高，但操作簡(jian)單。
（1）小鼠禁食過夜(ye)，并(bing)預先用NAC和毛果蕓香(xiang)堿處理(li)以(yi)促進腸道隱(yin)窩黏(nian)液排出。
（2）使用異氟醚將小鼠麻醉。
（3）在不(bu)(bu)使(shi)用(yong)鎮(zhen)靜劑的狀態下，用(yong)1英(ying)寸不(bu)(bu)銹鋼的直圓(yuan)針(zhen)頭直腸(chang)(chang)注射300ul 20mM的NAC清洗結腸(chang)(chang)30min。
（4）再次麻醉小鼠，通過灌腸給予小鼠5*10E10vg，600uL體積量的AAV。
注(zhu)：可(ke)通過直腸注(zhu)射亞甲(jia)基藍觀察(cha)液體到(dao)達(da)盲腸的(de)預實驗，確定合適的(de)灌腸液體積。
腸系膜動脈（SMA）注射效果較(jiao)好，但對(dui)實驗條件和操作手法要求較(jiao)高，對(dui)小鼠(shu)傷害性也較(jiao)大。
（1）將小鼠以右側臥位固定在手術板上，保持四肢松弛，放入含2-4.5% O2的異氟醚誘導室進行麻醉(zui)。小(xiao)鼠深度麻醉(zui)后，將(jiang)其放(fang)在手術(shu)臺上(shang)，對小(xiao)鼠手術(shu)區域做去毛及消(xiao)毒(du)處理。
注：為(wei)保持小鼠體溫(wen)，可在(zai)手術(shu)板下放(fang)置加熱(re)墊。整個(ge)手術(shu)過程在(zai)手術(shu)顯微鏡下放(fang)大5-40倍(bei)進(jin)行操作(zuo)。
（2）手(shou)(shou)術開始前，皮下(xia)注射丁(ding)丙諾(nuo)啡(fei)進行手(shou)(shou)術鎮痛(tong)；沿左腋線(xian)最后一個肋(lei)間隙和肋(lei)下(xia)區域注射布(bu)比卡因進行局部鎮痛(tong)。
（3）沿(yan)著腋線和側(ce)腹，在脾臟區(qu)域的(de)左側(ce)皮膚上(shang)開一個(ge)1-2 cm的(de)切口，切開腹外斜肌，使用微型牽引器將皮膚和腹壁固定，并用溫(wen)鹽水紗(sha)布覆蓋小(xiao)腸防(fang)止縮(suo)回(hui)，暴露SMA。
（4）在放大20倍的(de)情況下，將(jiang)SMA輕輕地從腹膜后(hou)剝離，在SMA的(de)近端(duan)接頭(tou)周圍放置一個小的(de)穩定接頭(tou)連(lian)接注(zhu)射針(zhen)，使(shi)用微(wei)血管夾暫時切斷腹主動脈(mo)的(de)血液供應。
（5）將(jiang)定(ding)制(zhi)33號1/2”針(zhen)頭連(lian)接到250μl漢密爾頓TLL氣密性進樣針(zhen)注射器上，輕(qing)輕(qing)插入SMA進行病毒(du)注射（1*10E11vg, 200μL體積的(de)AAV8）。將(jiang)固定(ding)帶輕(qing)扎血管，防(fang)止注射部位泄(xie)漏。
注(zhu)(zhu)：注(zhu)(zhu)射過程中(zhong)使(shi)用顯微鏡觀察以確保(bao)注(zhu)(zhu)射可視準確。
（6）注(zhu)射后(hou)立(li)即(ji)取下針頭，縫合(he)注(zhu)射部位。取下固(gu)定帶(dai)和微血(xue)管夾，使血(xue)液(ye)回流至(zhi)小腸。使用無菌棉簽輕輕按(an)壓注(zhu)射部位進行止血(xue)。
（7）在腹腔內注射(she)1ml無(wu)菌(jun)溫鹽水(shui)后，對小(xiao)鼠進行(xing)縫合。
（8）術后(hou)每(mei)(mei)15min對小(xiao)鼠進行一次監測，直到小(xiao)鼠能夠腹臥。每(mei)(mei)2小(xiao)時對動(dong)物進行一次監測，直至放回籠中。
