維真生物采用2代慢病毒包裝系統來制備慢病毒。該系統為三質粒系統，包括1個包裝質粒(psPAX2)、1 個包膜質粒(pMD2G)、1個目的基因質粒和1株包裝細胞(293T cell)。下圖是慢病毒制備流程示意圖：
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1. 重組慢病毒的制備
| Day1: | 匯合度90%的10cm dishs HEK293T細胞（~ 6×107/dish）按1：1比例傳代至15cm dishs，第二天細胞匯合度達到90%-95%（~ 1.5×108/dish），培養基為Gibico高糖DMEM培養基（含10%FBS）。 | ||||||||||||||||
| Day2: |
1)轉染前2-3個小時更換培養基（含10%FBS)；
Mix 1和Mix 2分別混合后，室溫5-10min, 后將Mix 1和Mix 2混合，室溫30min，加入至15cm dish中。（細胞達到匯合度90%，細胞過少會影響轉染效率） |
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| Day3: | 6h-24h內更換新鮮培養基（含10%FBS），觀察轉染效率并拍照。 | ||||||||||||||||
| Day5: | 72h觀察細胞狀態并拍照。收取上清培養基，過0.45μm濾膜，上清培養基加入超速離心管中，配平后離心，25000rpm，4℃離心1.5h。棄上清，用適當病毒保存液回溶混勻溶解過夜。 | ||||||||||||||||
| Day6： | 收集病毒分裝，進行病毒滴度測定。 |
2. 重組慢病毒滴度測定
2.1 整合數法標定不帶熒光的重組慢病毒滴度
2.1.1 病毒感染細胞
①感染前6 h 在24孔細胞培養板中以2.5×105個細胞/孔 均勻接種HEK293細胞。
②將慢病毒進行梯度稀釋，共做3個梯度，即每孔（500μl 無雙抗、無血清的DMEM培養基）中含10 μl、1 μl、0.1 μl 病毒，振蕩混勻后加至接種好細胞的24孔板中，加病毒之前將培養板中的培養基吸凈。
③感染 18-20h 后，將培養板中的培養基更換為新鮮的DMEM完全培養基。
④感染 64-68h 后收集細胞并進行基因組DNA的提取。
⑤測定時，設置一組帶熒光的已知TU的慢病毒作為對照，以校驗檢測出的數值。
2.1.2 提取基因組DNA（按照AxyGEN 的基因組DNA提取試劑盒說明書進行操作）
2.1.3 qPCR檢測
① 以被測慢病毒載體梯度稀釋為標準品，慢病毒載體上的通用引物進行qPCR以獲得病毒整合拷貝數。
② 以Actin質粒梯度稀釋為標準品，Actin引物進行qPCR檢測樣品的基因組拷貝數以得到基因組拷貝數。
③ qPCR
qPCR反應體系如下：
| 組成成分 | 體積 |
| 2 × SYBR Green mix | 10 μl |
| Primers (Forward & Reverse mixture) | 0.8 μl |
| 超純水（DNase & RNase Free） | 7.2μl |
| 模板 | 2μl |
| Total | 20μl |
qPCR反應程序：
| 循環參數 | |
| 預變性95℃ | 3min |
| 95℃ | 5S |
| 60℃ | 15S |
| 72℃ | 15S+Plate Read |
| 39個循環 | |
2.1.4 計算慢病毒IU（Integration Unit）ml-1
IU ml-1=(C×N×D×1000)/V
| 注： | C=平均每基因組慢病毒整合拷貝數 | D=病毒的稀釋倍數 |
| N=感染時細胞的數目（約為2.5×105） | V=加入稀釋病毒的體積數 |
2.2 孔稀釋法標定帶熒光的重組慢病毒滴度
| Day1: |
細胞的準備 在96孔板中的每個孔中接種1-4×104個 HEK293細胞。 |
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| Day2: |
病毒的稀釋與感染
在Eppendorf管中做10倍梯度稀釋，分別是1~10-6梯度。棄去96孔板中原有的培養基，將稀釋好的病毒依次加入孔中，注意是兩個重復，并做好標記。
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| Day5: |
熒光計數與滴度計算 感染72h后，用熒光顯微鏡對熒光陽性細胞進行計數。數出最后兩孔的熒光細胞數，計算2個重復孔內的總數之和并計算出平均數，假設為A（倒數第二孔的熒光細胞平均數）和B（倒數第一孔的熒光細胞平均數）。 慢病毒滴度計算公式： 病毒滴度 (TU/ml) = （A+B×10）×1000/2/A孔病毒量（μl） 下面是GFP慢病毒的滴度檢測結果：
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3. 慢病毒的使用
3.1 重組慢病毒體外感染細胞
不同的細胞所使用的病毒MOI值會有所不同。建議在正式實驗前，在目的細胞中進行預實驗摸索最佳MOI值。
3.1.1 慢病毒感染目的細胞預實驗
為了節省病毒，推薦使用96孔板進行預實驗。操作步驟如下：
①第一天 細胞的準備
將目的細胞接種于96孔板中，細胞融合率為50%為最佳。為保證細胞生長良好，請保證細胞貼壁過夜。
②第二天 病毒的稀釋
取10μL慢病毒原液加入90μL培養液中做1:10稀釋（10-1），以此為起點做梯度稀釋直至稀釋10-7。可根據實際情況降低或提高稀釋倍數。
③第二天 感染目的細胞
取出提前準備好的96孔板，用準備好的病毒稀釋液替代舊培養液，注意保留未加入病毒的細胞孔作為對照組。
④第二至十天 觀察熒光或檢測
慢病毒對細胞的感染較慢，請在感染細胞后48、72、96、120小時分別觀察細胞中熒光表達情況（如果您選擇的產品不帶有熒光標簽，請在48、72、96、120小時分別收獲細胞并通過 Western-Blot 或其他檢測手段來檢測基因表達）。
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注意： |
由于不同細胞對慢病毒感染過程的承受能力不同，在加入病毒稀釋液后，請于12-24小時后觀察細胞狀態以確認加入的病毒量是否合適。
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3.1.2 慢病毒感染目的細胞
進行慢病毒感染實驗時可使用完全培養液（培養目的細胞用）稀釋。培養液中的血清、雙抗或其他營養因子不會影響慢病毒的感染效率。
以24 孔培養板為例，進行HEK293細胞的感染實驗操作步驟如下：
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注意： |
實驗前請按照不同的MOI 設置不同的感染孔，并根據MOI 和細胞數量計算所需要的病毒量。
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① 第一天 細胞的準備
在24孔培養板接種若干孔，每個孔內接種3-5×104個HEK 293細胞，鋪板時細胞的融合率為50%左右，每孔培養液體積為300μL，進行病毒感染時細胞的匯合度約為70%。
②第二天 病毒的準備
根據實驗的實際情況和MOI 值，用培養液準確稀釋慢病毒原液。
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注意： |
可使用PBS緩沖液或無血清培養液稀釋病毒原液。
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③第二天 感染目的細胞
在目的細胞和對照細胞中分別加入計算好的病毒液， 混勻后放于CO2培養箱（37 ℃、5% CO2）孵育過夜。
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注意： |
1）感染前細胞的狀態好壞對最終的感染效果高低影響很大，請務必保證加入病毒前，細胞處于良好的生長狀態。 2）若慢病毒對目的細胞的感染效率較低，可通過提高MOI 值提高病毒的感染效率，也可在培養液中加入維真生物助感染試劑ADV-HR來提高病毒的感染效率。
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④第三天 更換培養液
病毒感染細胞24小時后，更換培養液。
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注意： |
換液具體時間需視細胞狀態而定。如果慢病毒對細胞有明顯毒性作用，影響細胞生長狀態，最短可于加病毒4小時后更換新鮮培養液后繼續培養。
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⑤第六天 感染效率檢測
在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，計算慢病毒感染目的細胞的效率。如選擇的慢病毒載體不帶有熒光標記，可以通過Q-PCR(定量PCR)檢測目的基因的表達來評估感染效率。
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注意： |
1）慢病毒表達較慢，熒光表達所需時間較長，建議感染96小時后觀察熒光的表達。 2）感染后的細胞可以連續培養一周，通過觀察熒光表達的時間和強度來確定慢病毒對目的細胞的感染情況。 3）感染期間，請根據細胞生長的情況及時換液，以保證細胞良好的生長狀態。
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附件1：載體選擇 |
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基因過表達 |
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基因沉默 |
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基因編輯 |
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附表2：耗材 |
| 耗材名稱 | 貨號 | 品牌 |
| 細胞培養板 10cm | 704001 | NEST |
| 細胞培養板 15cm | 715001 | NEST |
| 10ml血清移液管 | 4488 | Corning |
| 50ml血清移液管 | 4490 | Corning |
| 100-1250無菌加長帶刻度濾芯槍頭 | TF112-1000-Q | QSP |
| 細胞凍存管 | 377267 | Corning |
| DMEM高糖培養基 | C11965500BT | GIBICO |
| HEPES溶液 1M | SH30237.01 | HyClone |
| 青霉素-鏈霉素溶液（100*） | C0222 | 碧云天 |
| 胎牛血清 | 1122050 | Gibico |
| 0.25%胰蛋白酶 | SH30042.01 | Hyclone |
| 10xPBS | ST476 | 碧云天 |
| DMSO | D8372 | SOLARBIO |
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附表3：儀器 |
| 儀器名稱 | 規格型號 | 品牌 |
| 生物安全柜 | BSC-1300IIA2 | 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司 |
| 倒置顯微鏡 | CKX31SF | OLYMPUS |
| 實時熒光定量擴增儀（QPCR儀） | CFX96 | BIO-RAD |
| 熒光顯微鏡 | ELWD0.3 | Nikon |
| 超低溫保存箱 | DW-86L386 | 青島海爾特種儀器有限公司 |
| 臺式高速冷凍離心機 | 1580R | LAB GENE 基因有限公司 |
400-077-2566
service@wzbio.cn
