維真生物腺相關病毒包裝采用的是經典的三質粒共轉染法（Helper-free AAV包裝系統，即AAV無輔助病毒系統），該系統包括3個載體和1株包裝細胞：3個載體【載體質粒（含有目的基因表達盒，其兩端是AAV2的反向末端重復序列）、包裝質粒（反式提供具有AAV復制和包裝功能的蛋白Rep和Cap）和輔助質粒（含有輔助病毒Ad5的重要元件E1a、E1b、E2a、E4等）】和1株包裝細胞（HEK293T cell）。腺相關病毒包裝的具體示意圖如下：
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1. 腺相關病毒重組載體構建
1) 根據客戶實驗目的和受試細胞選擇不同的載體，在此以人源ORF為例。
2) 維真生物公司AAV載體的MCS區與人源ORF cDNA克隆現貨庫中的MCS區相兼容，可以通過簡單酶切-連接-轉化的方式將目的基因亞克隆至目標AAV表達載體，得到陽性克隆后通過測序以確認插入片段的正確性。
2. 細胞凍存
1) 按照細胞培養流程，將對數生長期的細胞吹下來加入50mL離心管中，200g離心5min。
2) 配制凍存液，90% 血清，10% DMSO，混勻。
3) 離心后去上清，將配制的凍存液加入，將細胞吹勻。
4) 取上述溶液每1mL分至1.5mL 細胞凍存管中，做好標記和日期。
5) 將凍存管放入裝有異丙醇的凍存盒中，放入-80℃冰箱過夜。（凍存盒要提前一天從冰箱中拿至室溫，使異丙醇的溫度達到室溫，每次凍存前確保異丙醇的加入量在刻度線上）；
6) 第二天將凍存盒放入液氮或 -150℃冰箱中以長期保存；同時取一支細胞做復蘇檢測，以判斷該批細胞的凍存質量。
3. 細胞復蘇
1) 10cm dish中加10ml新鮮DMEM培養基，放培養箱預熱至37℃。
2) 從液氮中取出冷凍管，迅速投入 37 ℃～38℃水浴中，使其融化（1-2 分鐘左右）。
3) 待細胞凍存管中溶液融化后，200g離心5min，棄掉液體并吸取1ml預熱的培養基將細胞沉淀輕輕吹起，轉移到10cm dish中。
4) 搖晃均勻，置于培養箱培養。
5) 培養過夜，更換新鮮培養基（除去凍存液中DMSO對細胞的毒害作用）。
4. 細胞傳代（以10cm dish為例）
1) 生物安全柜紫外滅菌半小時。
2) 滅菌期間，將DMEM培養基(含10%FBS，1%青鏈霉素混合液)和PBS置于37℃水浴鍋中預熱；0.25% 胰酶放置室溫，不可水浴加熱。
3) 取匯合度接近100%且活性較好的HEK293T 細胞，吸棄培養盤中培養基，加入約5mL，1×PBS，搖晃幾下，吸棄PBS。
4) 加1mL 0.25% 胰酶在生物安全柜內消化約1min，室溫低時可放置于培養箱中消化。消化時間不宜過長，否則影響細胞再次貼壁效率和活性。
5) 加入約5mL預熱的培養基，終止消化。
6) 用移液管吹打均勻（吹打過程中不可用力過大，否則會吹破細胞），按照1:3的比例傳代。各取2mL培養基至新的10cm dish中，再加入 8mL預熱的DMEM 培養基。
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注意：
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傳代盤數較多時，要先將預熱的 DMEM 培養基加入到 10cm dish中，再加入含細胞的培養基，以避免細胞分布不均勻。置于培養箱前輕輕混勻dish中的培養基，使細胞均勻分散于培養基中。
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5. AAV病毒包裝（以10cm dish為例）
Day1：匯合度90%以上的HEK293T細胞按1：3比例傳盤（每盤大約2.5× 106），培養基為Hyclone高糖DMEM培養基（含10%FBS）。
Day2：轉染前1-2h左右，換成無血清培養基。
按照以下比例配制轉染試劑：
| Mix 1 | 體積μl | Mix 2 | 量 |
| DMEM（無FBS） | 500μl | DMEM（無FBS） | 500μl |
| LTR-plasmid | 5μg | ||
| VGF | 60-70μl（1μg/μl） | RC-plasmid | 6μg |
| AAV-helper | 10μg |
Mix 1和Mix 2分別混合后，室溫5-10min, 后將Mix 1和Mix 2混合，室溫15-30min，逐滴加入至10cm dish中。（此時細胞匯合度在80%-90%比較適宜，細胞過少會影響轉染效率）
Day3：質粒轉染24h后，換新的無血清培養基。
Day5：轉染72h收毒，將產毒的細胞連同培養基一起收集至50ml離心管中，離心，分別收獲培養基上清與細胞沉淀：PEG8000沉淀培養基上清中的病毒；裂解細胞沉淀收毒；合并從細胞沉淀和上清中得到的AAV。
6. AAV 病毒純化與濃縮
6.1 純化——碘克沙醇密度梯度離心。
① 配制不同濃度的碘克沙醇；
② 取一個超離管，用電動移液器逐層、緩慢加入不同濃度的碘克沙醇；
③ 將處理好的病毒液加入到最上層；
④ 配平后超速，18℃、48000rpm、2.5h離心。
6.2 濃縮
① 離心完畢后，將超濾管底用針頭刺破，收集腺相關病毒所在層至15mL管中；
② 將收集的病毒液注入濃縮柱中，加PBS+0.001%PF68至滿，混勻；
③ 4000rpm，10℃，離心約1h。
④ 將超濾管中剩下的液體反復吹打后吸至病毒儲存管中，最后加入病毒儲存液，標明名稱和日期。
⑤ 將收集起來的病毒渦旋震蕩混勻后離心，吸 10μL 病毒液進行滴度檢測。
7. 病毒滴度檢測方法
實時定量PCR法是一種簡單的、高通量的測定純化病毒樣本中腺相關病毒顆粒數量的方法。每個模板的Ct值與該模板起始拷貝數的對數存在線性關系，利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析。
7.1 去除游離DNA分子
先將病毒稀釋10倍，以保證樣品中游離的DNA充分降解：取5μl病毒至45μl PBS緩沖液中，充分混勻。按以下體系配制Mixture：
| 組成成分 | 體積 |
| 超純水（DNase & RNase Free） | 4 μl |
| DNAaseI | 1 μl |
| 10×DNAaseI Buffer | 1 μl |
| 病毒稀釋液 | 4μl |
| Total | 10μl |
37 ℃ 孵育 30 min，95℃加熱 5min 使 DNA 酶失活。
7.2 去除病毒蛋白外殼
向上述體系中再加入 1μl 蛋白酶 K（5μg/μl）。37 ℃ 孵育 30 min；再加30ul超純水稀釋至40ul（至此病毒原液稀釋100倍），95℃加熱 5 min使蛋白酶 K 失活，然后 12000rpm，離心 2min，取上清進行 qPCR 檢測。
37 ℃ 孵育 30 min，95℃加熱 5min 使 DNA 酶失活。
7.3 qPCR
將步驟2得到的上清，取 5μl 進行 10 倍梯度稀釋，即病毒原液稀釋了 1000 倍。分別取 2μl 待測樣品及標準品作為模板進行 qPCR 檢測。
qPCR反應體系如下：
| 組成成分 | 體積 |
| 2 × SYBR Green mix | 10 μl |
| Primers (Forward & Reverse mixture) | 0.8 μl |
| 超純水（DNase & RNase Free） | 7.2μl |
| DNA | 2μl |
| Total | 20μl |
qPCR反應程序：
| 循環參數 | |
| 預變性95℃ | 3min |
| 95℃ | 5S |
| 60℃ | 15S |
| 72℃ | 15S+Plate Read |
| 39個循環 | |
7.4 數據分析
病毒顆粒數的計算：病毒顆粒數(VP/mL) = 與標準品相對值×1000
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附件1：載體選擇 |
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基因過表達 |
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基因沉默 |
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基因編輯 |
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附表2：耗材 |
| 耗材名稱 | 貨號 | 品牌 |
| 細胞培養板 10cm | 704001 | NEST |
| 細胞培養板 15cm | 715001 | NEST |
| 10ml血清移液管 | 4488 | Corning |
| 50ml血清移液管 | 4490 | Corning |
| 100-1250無菌加長帶刻度濾芯槍頭 | TF112-1000-Q | QSP |
| 細胞凍存管 | 377267 | Corning |
| DMEM高糖培養基 | C11965500BT | GIBICO |
| HEPES溶液 1M | SH30237.01 | HyClone |
| 青霉素-鏈霉素溶液（100*） | C0222 | 碧云天 |
| 胎牛血清 | 1122050 | Gibico |
| 0.25%胰蛋白酶 | SH30042.01 | Hyclone |
| 10xPBS | ST476 | 碧云天 |
| DMSO | D8372 | SOLARBIO |
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附表3：儀器 |
| 儀器名稱 | 規格型號 | 品牌 |
| 生物安全柜 | BSC-1300IIA2 | 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司 |
| 倒置顯微鏡 | CKX31SF | OLYMPUS |
| 實時熒光定量擴增儀（QPCR儀） | CFX96 | BIO-RAD |
| 熒光顯微鏡 | ELWD0.3 | Nikon |
| 超低溫保存箱 | DW-86L386 | 青島海爾特種儀器有限公司 |
| 臺式高速冷凍離心機 | 1580R | LAB GENE 基因有限公司 |
400-077-2566
service@wzbio.cn
