逆轉錄病毒載體系統通常指的是稱為γ逆轉錄病毒,表達系統由逆轉錄表達載體、輔助載體(表達病毒包裝需要的蛋白質)和包裝細胞系組成,由于逆轉錄病毒載體能將單鏈RNA(ssRNA)基因組轉換為dsDNA分子,可以高效的將外源基因穩定的整合到哺乳動物細胞基因組,目前已被廣泛應用于基因轉移載體系統。逆轉錄病毒通常指的是稱為γ逆轉錄病毒,包括MMLV(莫洛尼氏鼠白血病逆轉錄病毒)和MSCV(鼠干細胞病毒)。其優勢之一是載體基因組永久整合到宿主基因組中,可長期穩定地表達轉基因。但是由于無法穿過核膜,只能在細胞分裂過程中通過不完整的核膜來感染細胞,因此只能感染分裂期的細胞。其缺點主要體現在一是載體容量較小,二是包裝的病毒滴度較低。從病毒應用來看,MMLV可以高效的將外源基因穩定整合到宿主基因組的病毒載體,在IPSC制備中也比較受歡迎,MSCV則比較適合胚胎干細胞、胚胎癌細胞、造血干細胞等的轉基因表達。
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逆轉錄病毒介紹
逆轉錄病毒(Retrovirus),又稱反轉錄病毒,是一類RNA病毒,需在逆轉錄酶的作用下首先將RNA轉變為cDNA,新合成的cDNA插入宿主的核DNA中,隨宿主DNA復制、轉錄、翻譯達到擴增目的。逆轉錄病毒科可分為7個屬:α逆轉錄病毒屬(Alpharetrovirus)、β逆轉錄病毒屬(Betaretrovirus)、γ逆轉錄病毒屬(Gammaretrovirus)、δ逆轉錄病毒屬(Deltaretrovirus)、ε逆轉錄病毒屬(Epsilonretrovirus)、慢病毒屬(Lentivirus)和泡沫病毒屬(Spumavirus)。
逆轉錄病毒結構
逆轉錄病毒是一種RNA病毒,其兩端為長末端重復序列(LTR),病毒顆粒為二十面體對稱結構、球形,有包膜,表面有刺突,大小約80-120nm,基本結構包括包膜蛋白、基質、衣殼蛋白、核衣殼蛋白,以及病毒復制所需的酶(包括逆轉錄酶、整合酶、蛋白酶)。
逆轉錄病毒結構圖
逆轉錄病毒基因組
逆轉錄病毒的基因組為二倍體,含兩個相同單鏈RNA(+ssRNA),是一種連續線性單鏈RNA,長度為7-12 kb。簡單逆轉錄病毒的基因組包含三個主要的編碼段和一個小的編碼域,主要片段包含三個基因gag、pol和env: gag基因編碼病毒衣殼、基質等結構蛋白的基因,pol基因編碼逆轉錄酶(p66/p51)、蛋白水解酶和整合酶,env基因編碼gpl20和gp41兩種包膜糖蛋白;小編碼域包含前基因pro,該基因編碼病毒蛋白酶。
逆轉錄病毒基因組結構圖
(Endogenous Retroviruses in the Genomics Era)
逆轉錄病毒感染細胞過程
逆轉錄病毒只能在宿主細胞內復制,主要包括以下過程:病毒吸附在細胞表面,病毒包膜蛋白與細胞表面受體結合,囊膜與細胞膜融合,病毒顆粒進到細胞內,基因組RNA逆轉錄為雙鏈DNA,進入細胞核并整合到宿主染色質上,轉錄產生病毒RNA;病毒RNA從細胞核遷移到細胞質中,翻譯產生病毒蛋白,經過自組裝后,包裹病毒基因組RNA形成未成熟病毒顆粒,以出芽的方式釋放到細胞外,經病毒蛋白酶剪切多蛋白,成為成熟的子代病毒顆粒。
逆轉錄病毒可以與多種細胞表面蛋白結合而進入細胞,其宿主細胞范圍很廣,主要由病毒顆粒表面的包被蛋白(env)決定。
逆轉錄病毒特點
1、逆轉錄病毒具有廣泛的宿主范圍,可以廣泛感染多種細胞類型,且整合率高;
2、逆轉錄病毒能與宿主細胞DNA整合,可以介導外源基因穩定、長期表達;
3、逆轉錄病毒主要感染分裂期的細胞,適用于干細胞相關的研究。
逆轉錄病毒包裝示意圖
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2、可接受客戶提供包裝質粒,進行逆轉錄病毒包裝;
3、載體全,可進行MMLV(莫洛尼氏鼠白血病逆轉錄病毒)和MSCV(鼠干細胞病毒)的逆轉錄病毒包裝;
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